Selektion von Aptameren für Amyloid β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit

Teil 1: Protein Vorbereitung und Vernetzung

Zunächst wird das Protein für SELEX verwendet mit 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP) vorbehandelt, um eine homogene, Aggregat-freie Präparate, wie zuvor beschrieben ^{23 zu} erhalten. Dieser Schritt ist notwendig, weil vorgeformte Aggregate induzieren schnelle Aggregation von Proteinen amyloidogene, was zu einer schlechten experimentelle Reproduzierbarkeit ^24, und sind für die Selektion von Aptameren für aggregierte, nicht-fibrillären Formen des Proteins unerwünscht.

1. Abwiegen ~ 800 pg (~ 180 nmol) reine Aβ40 mit einer Mikrowaage. Übertragen Sie die trockene lyophilisierte Peptid in beschriftete, Silizium beschichtet, low-Adsorbens 1,6-ml Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Lösen Sie das Peptid in 100% 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP, 400 ul) bis 0,5 mM Peptid-Lösung, wie zuvor beschrieben erhalten ^23.
3. Teilen Sie diese Lösung in vier 100-ul-Aliquots, so dass jede Röhre ~ 45 nmol Aβ40 enthält nominell. Gehen Sie zur Entfernung von HFIP wie zuvor beschrieben ^23.
4. Vor Solubilisierung der HFIP behandelten Peptide in Puffer für Vernetzungsreaktionen, bereiten die Vernetzung und Abschrecken Reagenzien. Abwiegen Ammoniumpersulfat (APS, MW 228,2 g / mol) und bereiten eine Lösung von 40 mM in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4. Mix mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist.
5. Bereiten Sie 2 mM Lösung von Tris (2,2-Bipyridyl) dichlororuthenium (II)-Hexahydrat (Rubpy, MW 748,63 g / mol) in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4. Mix mit einem Vortex und überprüfen vollständige Auflösung. Schützen Sie das Rohr von Licht mit Aluminiumfolie.
6. Bereiten Sie die Abschreckung Reagenz. Abwiegen Dithiothreitol (DTT, MW 154,5 g / mol) und lösen sich in deionisiertem Wasser oder in 10-mM Natriumphosphat, pH 7,4, 1 M.
7. Lösen Sie die HFIP behandelten Peptid genau wie zuvor ^23,25 beschrieben, aber Ziel ~ 60 nM Peptid-Lösung zu erhalten.
8. Führen picup zu einer Mischung aus oligomeren Aβ40 wie zuvor beschrieben ²³ zu generieren. Ein typisches picup Reaktion wird in einem Volumen von 20 ul, wo die Endkonzentrationen von Protein, Rubpy und APS sind 30 uM, 0,05 mM und 1 mM bzw. ²³ durchgeführt. Hier enthält die Mischung für picup verwendet 108 ul Protein, 6 ul Rubpy, 6 ul APS und 1 ul DTT und die Konzentration des Proteins, Rubpy und APS sind alle doppelt so hoch wie die typische Reaktion. Dies reduziert die Anzahl der picup Reaktionen durchgeführt werden und erhöht die Protein-Konzentration zur Entsalzung.

Teil 2: Entsalzung des Proteins Vorbereitung

Vor der Verwendung des Proteins für SELEX ist Entsalzung durchgeführt, um die Vernetzung Reagenzien für picup verwendet zu entfernen. Diese picup Reaktionsgemisch enthält die Vernetzungsreagenzien und ~ 55 nM Protein (nominal Konzentration).

1. Entfernen Sie die obere Kappe einer 5-ml Entsalzungssäule, unterstützen die Spalte von einem Ständer, Platz einen Becher unter den Auslauf der Säule, und entfernen Sie die Steckdose stecken. Lassen Sie den Pufferspeicher Durchströmung und sammeln in den Becher.
2. Äquilibrieren der Säule in 10 mM Ammoniumacetat, pH 8,3. Geben Sie 5 Harz-Bettvolumen (25 ml) dieses Puffers in 3-ml-Portionen auf die Säule und lassen Sie ihn durchströmen.
3. Inzwischen Label 8 Low-Adsorbens, Silizium-beschichtete 1,6-ml-Tuben und legen Sie sie in ein Röhrchen Rack.
4. Nach der Säule wird, tragen Sie eine 0,5-0,7-ml-Aliquot der picup Reaktionsgemisch pro Spalte pro Einzelzimmer Entsalzung nutzen (Spalten können gewaschen, gelagert werden, und äquilibriert für spätere Verwendungen). Lassen Sie die Protein-Mischung in die Spalte Harz tränken und entsorgen Sie die Durchströmung in das Becherglas.
5. Legen Sie das erste Sammelrohr unter der Spalte Steckdose. 0,5 ml Acetatpuffer auf die Säule und sammelt die ersten 0,5-ml-Fraktion fließt.
6. Wiederholen Sie die Schritte 2,4 und 2,5, und sammeln Sie bis zu acht 0,5-ml-Fraktionen in den entsprechenden Rohren.
7. Anzahl anderen Satz von 8 Low-Adsorbens, Silizium beschichtet, kleine 0,6-ml-Tuben und legen Sie sie in einem Rack. Label ein anderes Rohr als "leer". Nehmen Sie 150 ul jeder Fraktion und Transfer in die markierten 0,6-ml-Tuben. Verwenden Sie 20 pl für SDS-PAGE-Analyse (Abbildung 1), wie zuvor gezeigt ^23.
8. Transfer 150 ul 10 mM Ammoniumacetat, pH 8,3, in die leere Röhre. Verwenden Sie dieses Rohr auf den Rohling in einem Spektralphotometer eingestellt.
9. Messen Sie die Absorption in 130 ul jeder Fraktion bei λ = 280 nm in einer Quarzküvette.
10. Nach der Absorption wird gemessen, kombinieren die Fraktionen mit der höchsten Proteingehalt (in der Regel Fraktionen 3-5), mischen Sie mit einer Pipette, und halten eine 10-ul-Aliquot für die Aminosäureanalyse der tatsächlichen Protein-Konzentration (nicht dargestellt) zu bestimmen.
11. Teilen Sie die Probe in mehreren Aliquots von ~ 2 nmol Protein pro Rohr und lyophilisieren die Proben in einem Lyophilisator.
12. Nach Abschluss der Lyophilisation, behandeln Sie die Proben mit 100% HFIP nach wie vor.
13. Bewahren Sie die Röhrchen bei -20 ° C. Verwenden Sie einen Schlauch für jedes SELEX-Zyklus (siehe unten).

Teil 3: Verstärkung des synthetischen random ssDNA-Bibliothek durch PCR

Die synthetischen ssDNA-Bibliothek hier für SELEX genutzt 49 randomisierten Nukleotiden (A: T: G: C = 25:25:25:25%) durch konstante Regionen aus Klonierungsstellen (Bam HALLO, Eco RI) und eine T7-Promotor flankiert, wie zuvor beschrieben ^26.

1. Zur Verstärkung der Bibliothek, die Einrichtung eines Standard-PCR-Reaktion wie folgt: 202 ul entionisiertem Wasser, 40 ul 10x Taq DNA-Polymerase-Puffer, 2 ul ssDNA-Template (0,5 nmol), 120 ul 25 mM MgCl _2, 28 ul 10 mM Desoxynucleosidtriphosphat Mix (dNTPs), 1 ul Vorwärtsprimer (300 pmol), 1 ul Reverse-Primer (300 pmol) und 4 ul Taq-Polymerase.
2. Führen Sie die PCR-Reaktion mit einem Thermocycler mit folgenden Einstellungen: 5 min bei 94 ° C für initiale Denaturierung, 20 Zyklen von jeweils 94 ° C für 30 sec, 52 ° C für 30 Sekunden zum Glühen, 72 ° C für 30 sec für Erweiterung und letzte Verlängerung bei 72 ° C für 7 min.
3. Nach Abschluss der PCR-Reaktion, reinigen die amplifizierte DNA-Produkt mit dem Qiagen QIAquick PCR Purification Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Im Allgemeinen wird in diesen Experimenten die Konzentration und die Ausbeute an DNA sind 160 ± 10 ng / ul in 50 ul.
4. Überprüfen Sie, ob die Menge der DNA nach der PCR um 2% Agarose-Gelelektrophorese.

Teil 4: Erzeugung von ³² P-markierten RNA durch in-vitro-Transkription

1. Richten Sie die Transkription in einem O-Ring-capped, 1,6-ml-Tube nach den Anweisungen des Herstellers mit einigen Modifikationen wie folgt: 20 ul 5x T7-Transkription-Puffer, 7,5 ul jeweils 100 mM rATP, rGTP, rUTP, 1 ul 100 mM rCTP, 2 ul α ³² P-CTP (3000 Ci / mmol), 5-10 pg gereinigte DNA-Template (~ 30-40 ul der gereinigten DNA-Produkt), 10 ul Enzym-Mix, und Make-up zu einem Endvolumen von 100 ul indem Nuklease-freies Wasser.
2. Mischen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pipette, Zentrifuge die Mischung, und bei 37 ° C über Nacht.
3. Am Ende der Reaktion wurde die DNA-Vorlage entfernt werden. Add RQ1 RNase-freie DNase in einer Konzentration von 1 U / pg Template-DNA und Inkubation für 4 h bei 37 ° C, um die DNA-Template zu verdauen.
4. Nach 4 h, extrahieren Sie die RNA durch Zugabe von 1 Volumen von Citrat-gesättigtem Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (125:24:1, pH 4,7). Mix durch einen Wirbel für ~ 1 min und Zentrifuge bei 16.000 g für 2 min.
5. Übertragen Sie die obere, wässrige Phase in ein frisches Röhrchen oder verwerfen die untere Phase durch Absaugen mit einer Mikropipette. Add 1 Volumen Chloroform: Isoamylalkohol (24:1), mischen durch einen Wirbel für 1 min und Zentrifuge als in 4.4 beschrieben.
6. Übertragen Sie die obere, wässrige Phase in ein frisches Röhrchen oder verwerfen die untere Phase durch Absaugen mit einer Mikropipette. Residual Chloroform können Sie mit einem einfachen Spin (10 Sekunden) in einer Mikrozentrifuge und Entfernen der unteren Phase mit einer Mikropipette entnommen werden. In diesem Schritt ist es einfacher, die untere Phase statt der Überstand zu entfernen.
7. Zur Fällung der RNA, fügen 0,1-Volumen entspricht der 3M Natriumacetat, pH 5,2 und 1-Volumen entspricht der 2-propanol. Mix und in einem -20 ° C Gefrierschrank für 15 min.
8. Nach 15 min, drehen sich mit Höchstgeschwindigkeit, vorzugsweise in einem gekühlten Mikrozentrifuge bei 4 ° C, für 20-30 min zur Fällung der RNA Produkt.
9. Saugen Sie den Überstand vorsichtig, waschen Sie die RNA-Pellet mit 0,5 ml 70% Ethanol, Zentrifuge bei 4 ° C und entsorgen Sie die Ethanol durch Aspiration.
10. Übertragen Sie die Röhrchen mit dem RNA-Pellet zu einem Heizblock und trocknen Sie das Pellet bei 37 ° C für 5 min.
11. Lösen Sie die RNA-Probe in 150 mM STE-Puffer, pH 8,0 (versehen mit den Abbildungen ProbeQuant G-50 Mikrosäulen) oder Nuklease-freiem Wasser auf ein Volumen identisch mit der in-vitro Transkriptions-Reaktion, dh 100 ul (Schritt 4,1).
12. Erhitzen Sie das Röhrchen mit der RNA-Produkt bei 70 ° C für 10 min in einem Heizblock zugeben und durch einen Wirbel um RNA Auflösung zu erleichtern.
13. Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur.
14. Halten Sie einen 1-ul-Aliquot der RNA in ein beschriftetes 0,6-ml-Tube für Szintillationszählung und TBE-Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Teil 6).

Teil 5: Entfernen von nicht rechtsfähigen Nukleotiden, RNA Entsalzung und Szintillationszählung

Zum Entfernen der nicht rechtsfähigen Nukleotide, verwenden Sie zwei G-50 Säulen nach den Anweisungen des Herstellers.

1. Invert Spalten und mischen von einem Wirbel zum Harz resuspendieren.
2. Snap off der unteren Abschluss der Säulen bei Perforation mit dem Kunststoff-Werkzeugkoffer im Kit zur Verfügung gestellt und stellen Sie sicher, lassen Sie die Steckdose unberührt. Lösen Sie die Kappe eine Vierteldrehung und legen Sie die Spalten in saubere Sammelröhrchen in der G vorgesehen-50 Kit.
3. Drehen Sie die Spalten in der Sammlung Röhrchen bei 730 g für 1 min auf die Pufferspeicher zu entfernen.
4. Transfer-Säulen, zwei neue O-Ring-capped, 1,6-ml-Tuben und Last 50 ul von ³² P-markierte RNA-Probe pro Spalte direkt auf das Harz ohne Störung des Harzes.
5. Spin bei 730 g für 2 min auf die gereinigte markierte RNA zu sammeln. Nach diesem Schritt, werfen Sie die Spalten.
6. Transfer 1 ul der G-50-gereinigten RNA zu einer 0,6-ml-Tube für Szintillationszählung und Elektrophorese (Teil 6). Shop Lager RNA bei -20 ° C bis zur Verwendung für SELEX. Es ist wünschenswert, dass RNA innerhalb von 2 Tagen nach Kennzeichnung zu dessen Abbau und Verlust der Aktivität zu vermeiden verwendet.
7. Mit den beiden 1-ul RNA-Aliquots aus den Schritten 4.14 und 5,6 bis die Zählungen pro Minute (cpm / ul) mit einem Szintillationszähler gemessen. Hier verwenden wir die Triathler Tischgerät Szintillationszähler.
8. Übertragen Sie die Röhrchen mit der RNA-Probe innerhalb der Kunststoff-Adapter für ³² P Zählen verwendet, mit Triathler zur Verfügung gestellt. Legen Sie den Schlauch und den Adapter in die Zählkammer, schließen Sie den Deckel der Kammer, wählen Sie ³² P zählen, und drücken Sie Start zu zählen beginnt.
9. Berechnen Sie% label Einbindung dh% Einbau von α ³² P-CTP = (cpm / ul für "G-50" Probe ÷ cpm / ul für "TOTAL" sample) x 100. TOTAL Probe wird die Probe vor G-50 Reinigung.
10. Nach Szintillationszählung und Berechnung der prozentualen Aufnahme, berechnen die Ausbeute an RNA und spezifische Aktivität von RNA. Zum Beispiel, wenn die Zählungen für einen Pool von RNA vor (237.370 cpm / ul) und nach G-50-Reinigung (191.330 cpm / ul) Ausbeute 81% Einarbeitung, dann sind folgende vor dem Erhalt der Ausbeute an RNA berechnet:
    
    Von Schritt 4.1 wird der Betrag von α ³² P-CTP bei 3000 Ci / mmol und 10 Ci / ul:
    .
    Die Menge an unmarkiertem CTP verwendet wird:
    .
    Gesamtbetrag der CTP verwendet wird 100006.7pmol. Das Molekulargewicht der RNA wird wie folgt berechnet
    
    wo 321,45 g / mol ^{27 liegt} die durchschnittliche Masse von rNTPs ist, ist 100 bp der Anzahl der Basen in der Sequenz und 17 bp ist die Anzahl der Basen in der T7-Promotor, die nicht transkribiert werden. Subtraktion von 61,96 g / mol aus dem Oligonukleotid Molekulargewicht berücksichtigt Entfernung von HPO ₂ (63,98) und die Addition von zwei Wasserstoffatomen (2,02) ^27. Denn der 4 rNTPs ist CTP das limitierende Reagens, wenn alle CTP wurden eingebaut die theoretische Masse von RNA hergestellt worden wäre sein:
    .
    Da jedoch von 81% Einbau wird diese Masse nun 2156 pg. Counts pro pg RNA wäre dann
    
    wo 100 ul ist die Transkription Volumen und in Bezug auf die Mole: 26618,4 g / mol x 8874 cpm / ug = 2.4x10 ⁸ cpm / mol. Von hier aus die Menge an RNA in nmol und seine entsprechende Volumen für die Inkubation mit Protein verwendet werden kann zB berechnet werden, werden 5 ul RNA enthalten ~ 4 nmol RNA, dh
    
    In diesen Experimenten wurden 300 pmol bis 1 nmol Protein und 4 nmol bis 100 nmol RNA ²¹ verwendet.

Teil 6: Charakterisierung der RNA Produkt durch Elektrophorese und Autoradiographie

1. Zur Vorbereitung der Proben für die Elektrophorese, mit der 1-ul Aliquots der RNA vor und nach dem G-50 Reinigung von Schritten 4.14 und 5.6, bzw.. Add 4 ul STE-Puffer und 5 ul 2x Novex TBE-Harnstoff-Probenpuffer.
2. Erhitzen Sie die Proben bei 70 ° C für 5 min wie er üblicherweise für RNA-Elektrophorese (Heizung erwies sich als unnötig, da das Gel Auflösung der RNA-Proben mit und ohne Heizung ist das gleiche in diesem Versuchsaufbau) empfohlen.
3. Bauen Sie eine 6% TBE-Harnstoff-Polyacrylamidgel in der Gel-laufende Apparatur, füllen Sie die innerhalb und außerhalb Kammern mit 1x TBE-Harnstoff Novex Laufpuffer. Spülen Sie die Vertiefungen der Fertigteil-Gel mit dem Puffer durch eine 1-ml-Pipette.
4. Zentrifugieren Sie die RNA Rohre und laden Sie die Proben (10 ul insgesamt) unter Verwendung von Gel-loading Tipps. Führen Sie das Gel bei 180 V für 50 min.
5. Nach 50 min, zerlegen das Gel durch Aufbrechen der Kunststoff-Formenbau, entfernen und entsorgen Sie nur die kürzere Rückendeckung der Gel-Form, aber lassen Sie die mehr Rückhalt als Unterstützung für die Gel.
6. Reinigen Sie die Oberfläche des Werkstücks mit Decon (oder andere geeignete Radioaktivität Dekontaminationsmittel) machen, dass alle die kontaminierenden radioaktiven Flecken entfernt werden.
7. Legen Sie zwei Lagen Kunststofffolie Saran Wrap, wickeln Sie das Gel und die Kunststoffträger in der Zwei-STILLSCHWEIGENDEN Plastikverpackung.
8. Setzen Sie das Gel in Kunststoff, um ein Blatt eines gewickeltutoradiography x-ray-Film innerhalb einer Exposition Kassette in den dunklen Raum, unter sicheren Licht. Lassen Sie die Kassette bei -20 ° C für 60-90 min.
9. Entwickeln Sie den Film in den dunklen Raum unter sicheren Licht nach 60-90 min mit einem automatischen Film-Entwickler (Abbildung 2).

Teil 7: RNA-Protein Inkubation und Filter verbindlich

Zunächst werden die RNA-und Protein in Lösung inkubiert und anschließend die RNA-Sequenzen, die an das Protein binden, sind aus dem Non-Bindemittel getrennt. Als SELEX-Zyklen läuft, wird Filter verbindlich geben einen Hinweis auf Protein-RNA-bindenden Bereicherung.

1. Inkubieren Sie die RNA bei 90 ° C für 10 min zur Denaturierung und dann bei Raumtemperatur für 10 min bei langsamen Renaturierung.
2. Lösen Sie das Eiweiß aus Schritt 2.12 in 8 ul 60 mM NaOH und fügen 36 ul Nuklease-freies entionisiertes Wasser. Mit Ultraschall die Mischung für 1 min und fügen 36 ul 2x RNA Bindungspuffer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM MgCl _2, pH 7,5).
3. Mischen Sie die entsprechende Menge an RNA mit 20 ul 10x RNA Bindungspuffer und machen auf ein Volumen von 200 ul indem Nuklease-freies Wasser. Das Röhrchen "negative Kontrolle."
4. Mix 20 ul Protein und die gewünschte Menge der RNA mit 20 ul 10x RNA Bindungspuffer und machen auf ein Volumen von 200 ul mit Nuklease-freiem Wasser. Das Röhrchen "Reaktion".
5. Mix und die Röhrchen für 30 min bei Raumtemperatur. Unterdessen bereiten die Filter und die Filter-Bindung Setup für den nächsten Schritt.
6. Bringen Sie einen 125-ml Seitenarm Kolben, um ein Vakuum Einlass. Legen Sie eine vorgereinigt, porösem Glas Unterstützung für den Filter auf dem Seitenarm Kolben.
7. Lösungen 3 Filtermembranen in 2-3 ml 1x RNA Bindungspuffer in einem 35x10-mm-Petrischale für 10-15 min. Der erste Filter für die Einstellung der Vakuumsauger verwendet werden, die zweite für RNA-alone genutzt werden, werden Negativ-Kontrolle Filter verbindlich, und der dritte für Filter-Bindung der RNA-Protein-Gemisch verwendet werden.
8. Nach 30 min, Zentrifuge der Bindungsreaktion und die Röhren bei Höchstgeschwindigkeit für 5 min bei Raumtemperatur.
9. Schalten Sie das Vakuum und Ort der ersten Membran auf dem porösen Glas. Mit einer Mikropipette, tropft 0,5 ml RNA Bindungspuffer auf die Membran und stellen Sie das Vakuum auf langsamen Fluss der einzelnen Puffer fallen durch die Membran zu erlauben.
10. Legen Sie die zweite Membran auf das poröse Glas und mit den gleichen Durchfluss, gelten die Negativ-Kontrolle auf die Membran.
11. Bewerben 4x0.5-ml-Aliquots 1x RNA bindenden Puffer, um die Membran zu waschen und entsorgen Sie die Flow-Through. Beachten Sie, dass, wenn Pre-Clearing gewünscht wird, die Flow-Through für die RNA-Extraktion gehalten wird. Pre-Clearing entfernt RNA-Sequenzen, um den Filter zu binden.
12. Entfernen Sie die Negativ-Kontrolle Membran und in einen entsprechend markierten 1,6-ml-Tube für Szintillationszählung.
13. Ersetzen Sie die porösem Glas mit einer vorgereinigten zweite poröse Glasträger.
14. Legen Sie die dritte Platte auf den porösen Glas und Anwendung der Reaktionsmischung. Waschen Sie den Filter wie in Schritt 7.11 und entsorgen Sie die Flow-Through. Die Anzahl der Wäschen können in späteren Zyklen SELEX erhöht werden, um die Stringenz der SELEX Bedingungen zu erhöhen.
15. Entfernen Sie den Filter Festplatte aufnehmen und in ein 1,6-ml-Tube mit der Bezeichnung "Reaktionsmischung" und halten Sie für Szintillationszählung.
16. Führen Szintillationszählung wie in Schritt 5,8 und notieren Sie sich die Zähler für die jeweiligen Filter.
17. Berechnen Sie die Höhe der Filter-gebundene Radioaktivität im Vergleich zur gesamten Menge an Radioaktivität angewandt, um die Membranen (% Bindung). Dies gibt einen Hinweis auf verbindliche Bereicherung als SELEX fortschreitet.

Teil 8: RNA-Extraktion aus den Filtern

RNA wird aus dem Filter entnommen, um die Sequenzen, die an das Protein binden, erhalten. Diese Sequenzen sind für die nächsten SELEX-Zyklus verstärkt.

1. Nach Szintillationszählung, entfernen Sie die Bindungs-Reaktion Filter aus der Tube (aus Schritt 7,15) und in einen sauberen, trockenen, 35x10-mm-Petrischale.
2. Verwenden Sie ein sauberes Skalpell und einer Pinzette auf die Membran in kleine Stücke schneiden.
3. Mit der Pinzette, ersetzen Sie die geschnittenen Stücke der Membran in der gleichen Bezeichnung Rohr aus Schritt 8.1.
4. Add 400 ul Elutionspuffer (7 M Harnstoff, 3 mM EDTA, 100 mM Natriumcitrat, pH 5,0) und Inkubation der Röhrchen bei 95 ° C für 10 min.
5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit höchster Geschwindigkeit bei Raumtemperatur, absaugen, und sammeln Sie die Extraktion Butter in eine neue Bezeichnung Rohr.
6. Messen Sie die verbleibende Radioaktivität zählt in der Röhre mit der Membran Stücke durch Szintillationszählung die Effizienz der Extraktion zu beurteilen.
7. Wiederholen Sie die Extraktion (Schritte von 8,4 bis 8,6) dreimal. Der Wirkungsgrad nach 3 Extraktionen ist in der Regel ~ 95-96%.
8. In den Rohren, die die RNA extrahiert, fügen Sie 1 Volumen (400 ul) von Citrat-gesättigt (pH 4,7) Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (125:24:1). Mix durch einen Wirbel für ~ 1 min und Fliehkraftge bei 16.000 g für 2 min.
9. Übertragen Sie die obere, wässrige Phase in ein frisches Röhrchen oder verwerfen die untere Phase durch Absaugen mit einer Mikropipette.
10. Add 1 Volumen Chloroform: Isoamylalkohol (24:1), mischen durch einen Wirbel für 1 min und Zentrifuge bei 16.000 g für 2 min.
11. Übertragen Sie die obere, wässrige Phase in ein frisches Röhrchen oder verwerfen die untere Phase durch Absaugen mit einer Mikropipette.
12. Zur Fällung der RNA, fügen 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2, 3-4 ul Glykogen (10 ug / ul) als RNA coprecipitant und 1 Volumen entspricht der 2-propanol. Mix und in einem -20 ° C Tiefkühltruhe über Nacht.
13. Spin bei Höchstgeschwindigkeit, vorzugsweise in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C, für 20-30 min zur Fällung der RNA aus Schritt 8.12.
14. Nach Zentrifugation trennt sich die RNA in eine flüssige Phase, die kaum sichtbar ist. Saugen Sie den Überstand vorsichtig, ohne zu vertreiben diese kaum sichtbare Fällungsmittel Phase am Boden des Röhrchens.
15. Waschen Sie die RNA "Pellet" mit 0,5 ml 70% Ethanol, zentrifugieren Sie für 5 min bei Höchstgeschwindigkeit bei 4 ° C und entsorgen Sie die Ethanol durch Aspiration ohne Verdrängen der kaum sichtbaren Fällungsmittel Phase.
16. Lösen Sie das RNA-Pellet in 50 ul STE-Puffer und fahren Sie mit G-50 Reinigung wie in Schritt 5.

Teil 9: Reverse Transkription und PCR für die Fortsetzung SELEX-Zyklen

Um fortzufahren, um den nächsten Zyklus der SELEX hat RNA zu revers transkribiert, um DNA und durch PCR amplifiziert.

1. In 5 beschriftet 0,6-ml-Tuben, mix 3 ul des gereinigten, G-50-entsalzt RNA mit 2 ul 8-fach verdünnt, Reverse-Primer. Beschriften Sie ein Röhrchen "negative Kontrolle."
2. Inkubieren Sie die Mischung bei 70 ° C für 5 min, und dann auf Eis für weitere 5 min auf die Hybridisierung des Primers an die RNA zu ermöglichen.
3. Zu dieser Mischung auf Eis, fügen 6,4 ul Nuklease-freies Wasser, 4 ul ImProm-II 5x Reaktionspuffer, 1,6 ul 25 mM MgCl _2, 1 ul 10 mM dNTP-Mix, 1 ul RNasein Ribonuclease Inhibitor, 1 ul ImProm-II Reverse Transkriptase aus denen sich insgesamt 15 ul.
4. Für die Negativ-Kontrolle, fügen 7,4 ul Nuklease-freies Wasser und lassen Sie die Reverse Transkriptase. Beschriften Sie die Röhrchen entsprechend. Die negative Kontrolle ist eingeschlossen, um sicherzustellen, dass kontaminierende DNA aus einem vorhergehenden Zyklus ist nicht für den nächsten Zyklus SELEX verstärkt. Dieser Schritt prüft die Wirksamkeit der Verdauung von DNA-Vorlage durch RQ1 RNase-freie DNase in Schritt 4.3.
5. Verwenden Sie einen Thermocycler, die Reaktionsmischung bei 25 ° C Inkubation für 5 min, 42 ° C für 1 h zum Glühen und Erweiterung des ersten DNA-bzw. um 70 gefolgt ° C für 15 min auf die Reverse Transkriptase zu inaktivieren.
6. Nach der Reverse-Transkriptase-Reaktion, richten Sie den PCR-Mix. Zugabe von 30 ul Nuklease-freies Wasser, 10 ul 10x Taq-Puffer, 30 ul 25 mM MgCl _2, 7 ul 10 mM dNTP-Mix, 1 ul von jedem Primer und 1 ul Taq-Polymerase in allen Rohren.
7. Führen Sie die PCR-Programm wie in Teil 3 9-14 Zyklen.
8. Purify die DNA-Produkt, wie in Schritt 3.3.
9. Mix 8 ul DNA-Produkt mit 2 ul DNA Loading Dye und Elektrophorese auf 2% Agarose bei 100 V für 15-20 min (Abbildung 3).
10. DNA-Produkt bereit, um markierte RNA, wie in Teil 4 transkribiert werden und für den nächsten Zyklus der SELEX.

Teil 10: Repräsentative Ergebnisse

In SELEX-Experimenten sind die Art der Aβ40-Oligomere als das Ziel, die Qualität der RNA für jeden Zyklus verwendet und erfolgreichen RNA Extraktion und Amplifikation nach jedem Zyklus verwendet wichtig. Wir verwendeten picup zu einem oligomeren Aβ40 Mischung für SELEX nach Reinigung und Entfernung der Vernetzungsreagenzien generieren. Die Entsalzung Experimente in Teil 2 beschrieben in der Regel auf 50-55% Eiweiß-Verlust führen. Das Protein Menge und Qualität kann unter Verwendung von Absorptionsmessungen (λ = 280) und SDS-PAGE (Abbildung 1). Die durchschnittliche Extinktion Profil von Aβ40 Eluaten aus 5 einzelnen Experimenten Überlagerung einer typischen SDS-PAGE-Profil von Aβ40 in einem dieser Experimente eluiert sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Daten zeigen, dass das Protein konstant eluiert von der Säule in Fraktionen 3-5 und die Vernetzungsreagenzien eluieren nach Bruchteil 6 (erhöhte Absorption in der Fraktion 7, Abbildung 1). SDS-PAGE zeigt den typischen Aβ40 Oligomerverteilung ^22. Diese Verteilung war reproduzierbar, nachdem das Protein Fraktionen wurden lyophilisiert (2,11), behandelt mit HFIP (2,11), resolubilisiert (7,1), und durch SDS-PAGE erneut analysiert.

Integrität der RNA für die einzelnen SELEX-Zyklus ist auch für iterative Fortschreiten der SELEX wichtig, besonders wenn Nuklease-anfällig Ribo-Oligonukleotide verwendet werden. Nach RNA-Amplifikation und Kennzeichnung (Teil 4), kann die Qualität der markierten RNA durch TBE-Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese beurteilt werden. Ein typisches Profil einer intakten markierte RNA-Produkt vor und nach der G-50-Reinigung (Part 5) ist in Abbildung 2 dargestellt.

Nach jeder SELEX-Zyklus wird RNA von der Membran nach Filter-Bindung (Teil 8) und revers transkribiert (Teil 9), um DNA für die PCR-Amplifikation (Schritt 9,5) extrahiert. Die DNA-Vorlage aus einem früheren Zyklus wird dann verwendet, um ³² P-markierte RNA (Teil 4) für den nächsten Zyklus zu erzeugen. Wenn einige kontaminierenden DNA-Vorlage aus einem vorhergehenden Zyklus besteht in der markierten RNA Produkt nach in-vitro-Transkription Reaktionen (Teil 4) wird die Effizienz der SELEX-Zyklen reduziert werden, fordern mehr Zyklen. Zur Kontrolle dieser, nach jeder SELEX Zyklus und den entsprechenden Reverse-Transkriptase-PCR-Reaktion wird Agarosegelelektrophorese durchgeführt (9,12). Fehlen von DNA-Produkt in der Negativ-Kontrolle Reaktionsgefäße (9,4) zeigt die erfolgreiche Entfernung der DNA-Vorlage, die aus einer früheren SELEX-Zyklus (Abbildung 3). Wenn DNA-Amplifikation mittels PCR in der Negativ-Kontrolle Rohr beobachtet wird, ist es ratsam, dass die Dauer der Inkubation mit RQ1 DNase (4,3) verlängert werden. Der vom Hersteller empfohlene Inkubationsdauer mit RQ1 DNase ist 15 min, allerdings fanden wir, dass mehr Inkubationen (4-5 h) erforderlich waren, um die Template-DNA vollständig zu entfernen (Abbildung 3).

Abbildung 1. SDS-PAGE und Absorption Profil picup-generated, entsalzt Aβ40-Oligomere. Die Absorption Profil aus 5 einzelnen Entsalzungssäulen wurde gemittelt und überlagert auf einer repräsentativen Gels. Molekulargewichtsmarker sind auf der rechten Seite angezeigt.

Abbildung 2. TBE-Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von RNA Produkt vor und nach der G-50 Reinigung. Die Migration Richtung RNA Produkt ist von der Kathode zur Anode, wie angegeben.

Abbildung 3. Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Produkt nach der reversen Transkription und PCR-Amplifikation.

Der Ausgangspunkt des SELEX-Verfahrens ist die Synthese eines zufälligen Oligonukleotid-Bibliothek, die typischerweise 10 ¹² -10 ¹⁵ Sequenzen. In DNA SELEX, diese Bibliothek direkt verwendet wird nach einer ssDNA-Pool generiert wird, während in RNA SELEX, hier demonstriert, ist die ssDNA-Bibliothek erst konvertiert, um ein RNA-Pool enzymatisch durch in-vitro-Transkription. Dann wird SELEX iterativ, wobei jeder Zyklus umfasst Belichtung und Bindung von Oligonukleotiden an das beabsichtigte Ziel durchgeführt, die Partitionierung von Bindemitteln aus unverbindlichen Sequenzen und Elution der bindenden Sequenzen. In späteren Zyklen, kann die Stöchiometrie der Ziel-und RNA und / oder die Anzahl der Wäschen verändert werden, oder kompetitive Inhibitoren kann in der Bindung oder Waschpuffer hinzugefügt werden, um die Stringenz der SELEX Bedingungen zu erhöhen. Filter Bindung ist eine klassische, einfache und schnelle Methode zur SELEX ¹⁰ verwendet, obwohl zahlreiche Methoden wurden ²⁸ für die Bindung und Partitionieren erläutert. Filter-Bindung ist ideal für die Erfassung und Selektion von RNA-Target-Wechselwirkungen in Lösung. Wenn die Auswahl richtet sich an kleine Moleküle oder Peptide sind, wird die Porengröße der Membran in Filter-Bindung verwendet ein limitierender Faktor und ein wichtiger Gesichtspunkt.

Nach Elution werden die Ziel-bindenden Oligonukleotiden amplifiziert und für weitere Zyklen. Bei der Verwendung von DNA-SELEX, können die angereicherten Pool durch PCR direkt und verwendet werden, für den nächsten Zyklus nach Aufschluss der komplementären Sequenz und DNA-Markierung. Bei der Verwendung von RNA SELEX hat diesen Pool an DNA durch reverse Transkription umgewandelt werden und dann durch PCR amplifiziert, in-vitro transkribiert und wieder für die Fortsetzung auf den nächsten Zyklus bezeichnet. Normalerweise sind 8-20 solcher Zyklen erforderlich, um eine angereicherte Aptamer-Pool, die anschließend kloniert und individuelle Aptamere sind sequenziert und charakterisiert erhalten. In Studien mit Amyloid-Proteine, die Charakterisierung von Aptameren ist besonders wichtig, weil die inhärenten Affinität von Oligonukleotiden für fibrilläre Amyloid Strukturen potenziell behindert die Entwicklung von Aptameren spezifisch für nicht-fibrilläre Amyloid-Proteine ​​unter physiologischen Bedingungen ^21. Diese inhärente, Sequenz-unabhängige Affinität von Oligonukleotiden kann die Erzeugung von Fibrillen-kreuzreaktive Aptamere in Studien mit dem Ziel, um Aptamere für nicht-fibrillären amyloidogenen Proteinen ^17,19-21 generieren geführt haben. Kürzlich berichteten Takahashi et al. Generierung von RNA-Aptameren gegen einen oligomeren Modell Aβ40 und zeigten Reaktivität mit monomeren Aß mit mikromolaren Affinität ^29. Allerdings war Kreuzreaktivität dieser Aptamere mit fibrillären Aβ40 oder mit anderen fibrillären amyloidogene Proteine ​​nicht bestimmt.