电离辐射的反应定量的γH2AX灶

细胞制备

1. 生长在角质形成细胞无血清培养人角质形成细胞（FEP - 1811）（K - SFM; Invitrogen公司）与表皮生长因子，牛垂体提取物和20微克/毫升庆大霉素的补充，在37 ° C和5％的_CO 2 。
2. 用胰酶- EDTA（0.05％V / V）分离制备单细胞悬液
3. 细胞接种于8实验室TEK第二microchamber幻灯片（万细胞/孔）和幻灯片，在37 ° C和5％的CO ₂孵育3天。

放射

1. 冰使用^{的137 Cs}源（1000 Gammacell精英辐照; Nordion公司国际上，加拿大; 20.6秒/ GY）与2戈瑞辐照细胞
2. 未经辐照的控制和2 Gy照射细胞孵育1小时37 ° C和5％的_CO 2 。

免疫荧光染色

1. 媒体通风报信，洗涤细胞，每孔300μL的PBS（W / O CA ^{2 +}或Mg ^{2 +的} ），并在5分钟的轨道混频器的旋转。
2. 缓冲区是通风报信，新鲜配制的4％多聚甲醛（V / V），每孔加入幻灯片在室温下孵育10分钟100μL。
   所有孵化加湿染色槽
3. 细胞，然后用PBS（W / O型的Ca ^{2 +，Mg 2 +的} ）。 5分钟的轨道混频器，幻灯片被放置在一个Coplin JAR和旋转。此清洗步骤再重复两次。
4. 缓冲区是通风报信，多余的PBS轻轻涂抹。
5. 使用100毫升TRITON X - 100（0.1％V / V），每口井，在室温下孵育10分钟的细胞透。
6. 细胞，用PBS冲洗（W / O型的Ca ^{2 +}或Mg ^{2 +的} ）如在上述步骤3和4中所述
7. 在室温下（1％V / V）与BSA的100毫升的非特异性蛋白结合，阻止每口井和20分钟的孵育。
8. 多余的BSA是通风报信，鼠抗磷酸化组蛋白H2AX的抗体（1:500稀释，在1％BSA; Millipore公司）100μL，在室温下孵育1小时，每口井。
9. 细胞用PBS冲洗（W / O型的Ca ^{2 +}或Mg ^{2 +）}的步骤3和第4段中所述和培养100μL二次抗体（的Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG稀释1:500，在1％BSA ; Invitrogen公司），每45分钟，在室温下在黑暗中。 （摊薄抗体，整个过程被蒙在鼓里）
10. 细胞，用PBS冲洗（W / O型的Ca ^{2 +}或Mg ^{2 +的} ）如在上述步骤3和4中所述然而，暴露在光线下是最小化使用铝箔。
11. 核counterstaining是用100ml TOPRO3（稀释1:500; Invitrogen公司）进行，每口井，在室温下孵育10分钟的
12. 细胞用PBS（W / O型的Ca ^{2 +}或Mg ^{2 +）}在第10步以上所述。
13. 该商会进行了仔细从幻灯片中删除多余的水分，涂抹和幻灯片被允许空气干燥。
14. 延长金防褪色的解决方案（Invitrogen）的下降，每孔加入幻灯片安装（22x50毫米盖玻片）和幻灯片的边缘周围的任何多余的液体被抹杀。
15. 被关在黑暗为进一步在室温下30分钟，然后用指甲油密封幻灯片。
16. 幻灯片一夜之间被储存在4 ° C的分析前的黑暗。

显微镜/分析

1. 蔡司LSM510 META共焦Microscpe用来获取图像，使用标准的绿色荧光蛋白（γH2AX - 的Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG）和远红光激光器（TOPRO - 3）。通常，一个63 ×油浸物镜使用。
   一个0.5微米的一步大小，图像采集在Z系列模式。一个0.5微米的一步大小选择不同的平面，以尽量减少损失灶目前在细胞核。在分析过程中，个别飞机卷积和堆放产生一个最大投射影像的疫源地，以尽量减少重叠（顶帽子过滤器适用于）。
2. Metamorph分子器件，（美国）是用来分析疫源地的数量。
   该计划定量灶，在每个单元的阈值后，已被应用到排除的背景。该信息被记录在Microsoft Excel电子表格，作进一步的分析。

图1。γH2AX灶（绿色）的免疫可视化未经处理的人角质形成细胞和细胞在2 Gy的照射，并为进一步的1小时在_37℃，5％的CO 2。 DNA染色TOPRO - 3（蓝色）。使用的Zeiss LSM 510 META激光共聚焦显微镜获得的图像。酒吧= 10微米。

暴露于电离辐射（γ射线），γH2AX灶形式迅速和疫源地号码后达到最大，在30-60 ^分钟之间2。因此，1小时后照射时间点反映初始DSB的形成。我们的实验中，我们已经用2 Gy的临床相关的辐射剂量。然而，该方法可用于辐射剂量高达4戈瑞检测初始DSB的形成;灶明显的重叠排除在较高剂量准确定量。可用于更高的辐射剂量辐照后的潜伏期较长时间，γH2AX灶因维修，造成量化的数字。通常情况下，4小时和24小时照射后孵育时间用于监测DNA修复。我们使用的DNA染色TOPRO - 3由于在我们的激光共聚焦显微镜激发激光器的限制。更常见的是，4,6 - diamidino - 2 - 苯基吲哚盐酸盐（DAPI）是用于核counterstaining。虽然我们使用共聚焦显微镜，ž与啶显微镜切片的能力是足够的。免疫荧光法适用于其他附着的癌细胞与正常细胞株，我们已经测试T98G人脑胶质瘤和正常的人类内皮细胞和大鼠H9C2胚胎心肌细胞。

最后，γH2AX定量在电离辐射诱导的DNA损伤，我们的实验和维修（放射敏感性）的DNA损伤监测所示的情况下是有用的。本试剂盒也可用于评估辐射（即辐射保护和增敏剂）调节细胞反应的化合物的疗效。此外，γH2AX是新兴作为一个潜在的衰老和疾病的分子标记，主要是在^癌症 10 。