En Fraccionamiento subcelular situ de células mamíferas adherentes y no adherentes-

I. Preparación para el fraccionamiento

En esta sección se describe la preparación de poli-L-lisina cubreobjetos recubiertos microscopio y la unión de las células antes de su fraccionamiento. Si es necesario que las células pueden ser transfectadas transitoriamente con los vectores de expresión de la proteína, ya sea antes o después de la unión.

A. Preparación de poli-L-lisina cubreobjetos recubiertos

1. Prepare una solución de 1mg/ml de poli-L-lisina en agua destilada.
2. Capa limpia cubreobjetos con poli-L-lisina, mediante su incubación en la solución de al menos 1 hora en una plataforma oscilante a 22 ° C.
3. Lave el cubreobjetos recubiertos con agua destilada estéril dos veces y seguir con un solo lavado con etanol al 96%.
4. Seque al aire los cubreobjetos recubiertos en un pedazo de papel de filtro y guardar en un recipiente seco para uso en el futuro (una vez seca se pueden apilar).

B. Fijación de las células a cubreobjetos

Las células no adherentes (aquí usamos células K562)

1. Coloque un cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina en un pozo en una placa de 6 pocillos con la superficie recubierta hacia arriba.
2. Semillas de las células K562 a una densidad de 7x10 ⁵ células / pocillo en Dulbecco modificado Eagles Medium (DMEM) suplementado con fetal al 10% de suero bovino (FBS) y PS (penicilina 100units/ml, 100mg/ml estreptomicina). En el caso de las células K562 de transfección transitoria se puede realizar utilizando electroporación (0.4cm cubetas de electroporación con 1x10 ⁷ células en 200μl de los medios de comunicación a 250 / 975μF) antes de la siembra de las células.
3. Se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C en 5% CO _2.
4. Se retira el medio y se lavan las células dos veces con fosfato helada (PBS).
5. Seguir con el protocolo de fraccionamiento subcelular.

Células adherentes (aquí usamos células COS-7)

1. Coloque un cubreobjetos sin revestimiento en un pozo en una placa de 6 pocillos.
2. Lavar dos veces en PBS precalentado a 37 ° C.
3. Separar las células por digestión con tripsina (0,03% de EDTA, 0,25% de tripsina) en PBS a 37 ° C durante 2 a 5 minutos. Es importante no pasar de digerir las células y para detener la digestión tan pronto como las células flotantes predominantemente individual están presentes.
4. Detener la digestión por la siembra de las células a una densidad de 3x10 ⁵ células / pocillo en una placa de 6 pocillos en DMEM suplementado con FBS al 10% y el PSG (penicilina 100 unidades / ml, estreptomicina y 100ug/ml 292ug/ml L-glutamina) , en cubreobjetos normal. Células adherentes en general, un buen agarre en cubreobjetos microscopio normal, sin embargo, el poli-L-lisina cubreobjetos recubiertos puede ser utilizado en caso necesario.
5. Se incuban las células durante 24 horas a 37 º C y 5% CO _2. En el caso de Cos-7 en células de transfección transitoria se puede realizar utilizando Fugene 6 (Roche), si es necesario y las células de la izquierda para recuperar por un período de 24 horas a 37 ° C y 5% CO _2.
6. Se retira el medio y se lavan las células dos veces con PBS enfriado con hielo.
7. Seguir con el protocolo de fraccionamiento subcelular.

II. Fraccionamiento subcelular

En la fracción de terreno se lleva a cabo de acuerdo con el esquema que se muestra en la Figura 1 y se basa en un método descrito anteriormente ⁵ con las modificaciones descritas anteriormente, ⁷ y en el protocolo se detalla a continuación. Se recomienda la transferencia de los cubreobjetos a un nuevo máximo de 6 pocillos después de cada paso de fraccionamiento quitar el cubre antes de retirar el líquido. Aunque sólo cuatro cubreobjetos se requieren para obtener imágenes, cubreobjetos adicionales se requieren para producir extracto de células enteras y fracciones nucleares matriz de Western Blot si esto se va a realizar en paralelo.

1. Preparar y el filtro del citoesqueleto de amortiguación (CSK): TUBOS 10 mM, sacarosa 300mm, 100mm NaCl, 3 mM _MgCl2, 1 mM EGTA. CSK de amortiguación debe prepararse en el día de fraccionamiento.
2. Si es necesario que las células de un cubreobjetos se puede utilizar para preparar el extracto de células enteras de Western Blot colocando suavemente 200ul tampón TES (SDS al 1%, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4) directamente sobre el portaobjetos y el período de incubación de 1 ó 2 minutos a 22 ° C. El extracto de células enteras se puede retirar y se precipitaron las proteínas mediante la adición de 250ul de 1 M (NH ^{4) 2} SO ⁴ e incubando en hielo hasta que las muestras occidentales están listos.
3. Lavar los cubreobjetos restantes con 1 ml de hielo frío PBS dos veces a 22 ° C por la inclinación del 6 y la placa dos o tres veces.
4. Quitar el cubre representan células enteras y la transferencia a un nuevo máximo de 6 pocillos. Siga con la fijación de células y el protocolo de inmunofluorescencia.
5. Retire con cuidado la PBS de los pozos restantes.
6. Extracto de las proteínas nucleares y citoplasmáticas en forma no estructurada colocando suavemente 200ul buffer CSK + 0,1% (V / V) de Triton X-100 directamente en cada cubreobjetos restantes e incubando enhielo durante 1 minuto.
7. Retire el extracto nuclear citoplasmática y en forma no estructurada y precipitar tal como se describe en el paso 2.
8. Lavar los cubreobjetos con 1 ml de PBS frío hielo dos veces a 22 ° C por la inclinación del 6 y la placa.
9. Retire el material de cubreobjetos representa firmemente sostiene, nuclear y seguir con la fijación de células y el protocolo de inmunofluorescencia.
10. Retire con cuidado la PBS de los pozos restantes a continuación, extraer las proteínas firmemente sostiene, colocando suavemente 200ul buffer CSK + 0,5% (V / V) de Triton X-100 directamente en cada cubreobjetos restantes e incubar en hielo durante 20 minutos.
11. Quitar el extracto firmemente sostiene, y se precipitan como se describe en el paso 2.
12. Lavar los cubreobjetos con 1 ml de PBS frío hielo dos veces a 22 ° C por la inclinación del 6 y la placa.
13. Quitar el cubre representa la fracción de la cromatina y seguir con la fijación de células y el protocolo de inmunofluorescencia.
14. Retire con cuidado la PBS de los pozos restantes coloque 200ul CSK de amortiguación + 100ug/ml de DNasa I en el resto de cubreobjetos y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C.
15. Quitar el extracto de la cromatina y se precipitan como se describe en el paso 2.
16. Lavar los cubreobjetos con PBS enfriado con hielo dos veces a 22 ° C por la inclinación del 6 y la placa.
17. Quitar los cubreobjetos que representa la fracción de la matriz nuclear y seguir con la fijación de células y el protocolo de inmunofluorescencia.
18. Si es necesario que las proteínas de la matriz se puede quitar de un cubreobjetos matriz adicional para el Western Blot con 200ul de amortiguación de los TES como se describe en el paso 2.
19. Las muestras para Western Blot se centrifuga a 13000 rpm en una microcentrífuga de sobremesa a 4 ° C y los pellets se resuspendieron en tampón de carga SDS 40ul (62,5 mm Tris-HCl pH 6,8, SDS al 2% (w / v), 50 mM DTT, 10% de glicerol, 0,01% azul de bromofenol (w / v)) antes del análisis por SDS-PAGE.
    
    Figura 1. Una representación esquemática del fraccionamiento subcelular en situ. Citoesqueleto de amortiguación (CSK) consiste en tubos 10 mM, sacarosa 300mm, 100mm NaCl, 3 mM _MgCl2, 1 mM EGTA. TES buffer consiste en SDS al 1%, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4.

III. Celular y la fijación de inmuno fluorescencia

1. Suavemente agregar 1 ml de formaldehído al 4% / PBS a cada cubreobjetos y se incuba a 4 ° C durante 30 minutos.
2. Lave cada cubreobjetos suavemente 2-3 veces con 1 ml de PBS a 22 ° C.
3. Añadir 400ul de X-100/PBS Triton 0.1% a cada cubreobjetos y se incuba a 22 ° C durante 10 minutos.
4. Lave cada cubreobjetos suavemente 2-3 veces con 1 ml de PBS a 22 ° C.
5. Añadir 400ul de bovino al 3% de albúmina sérica (BSA) / PBS y se incuba a 22 ° C durante 20 minutos para reducir el potencial de tinción de fondo.
6. Lave cada cubreobjetos suavemente 2-3 veces con 1 ml de PBS a 22 ° C.
7. 100 ul lugar del anticuerpo primario en PBS directamente sobre el portaobjetos y se incuba a 22 ° C durante 1 hora. Anticuerpos primarios y secundarios deben ser diluidas en PBS a la concentración requerida. Esto puede tener que ser optimizado para cada anticuerpo utilizado.
8. Lave cada cubreobjetos suavemente 2-3 veces con 1 ml de PBS a 22 ° C.
9. Lugar 200ul de secundaria de anticuerpos en PBS y se incuba a 22 ° C, protegido de la luz durante 1 hora.
10. Lave cada cubreobjetos suavemente 2-3 veces con 1 ml de PBS a 22 ° C.
11. Monte cada cubreobjetos (celdas hacia abajo) sobre un portaobjetos de vidrio con medio Vectashield montaje DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole clorhidrato).
12. Limpie el exceso de medio de montaje de todo el cubreobjetos con una toalla de papel y se incuba el portaobjetos a 22 ° C durante al menos 30 minutos de luz.
13. Fijar el cubreobjetos al portaobjetos de vidrio con esmalte transparente de uñas de acrílico.
14. Mantenga las diapositivas de la luz antes de la visualización por microscopía de fluorescencia.

IV. Los resultados representativos

Figura 2. Fraccionamiento subcelular de no transfectadas células COS-7. Fraccionado Cos-7 células fueron fijadas con formaldehído y immunostained utilizando α-tubulina, α-histona H1 o α-Lamin A anticuerpos / C conjugada con TRITC seguido por el tratamiento con medio de montaje DAPI . Las imágenes fueron adquiridas con lente ocular de 10x y lente objetivo de 63x utilizando un microscopio confocal Leica. Los núcleos celulares se visualizaron utilizando un conjunto DAPI filtro, mientras que en el mismo campo de las células teñidas con anticuerpos marcador se visualizaron utilizando un conjunto de filtros TRITC.

Figura 3. Una proteína de fusión GFP-6E2 está asociada a la matriz nuclear. Fraccionamiento subcelular de Cos-7 células que expresan una proteína de fusión que consta de una proteína fluorescente verde (GFP) fusionada con el virus del papiloma humano (VPH) tipos 6Proteína E2 (GFP-6E2). Los núcleos celulares se visualizaron mediante tinción con DAPI, mientras que la localización de GFP-6E2 en las células transfectadas se visualizan directamente a través de la fluorescencia de GFP. Lamin A / C se visualizan mediante α-anticuerpos Lamin A / C conjugada con TRITC y un conjunto de filtros TRITC. Las imágenes revelan que algunos fusión de la proteína GFP-6E2 está asociada a la matriz nuclear (panel inferior derecho). Las imágenes se obtuvieron como se describe en la figura 2.

Los problemas más comunes y sugerencias:

Todos o la mayoría de las células se pierden durante el lavado. Durante los pasos de líquidos de limpieza debe realizarse lentamente hacia el lado de la placa de 6 pocillos evitando el cubreobjetos. Del mismo modo los líquidos deben ser removidos cuidadosamente inclinando la placa y lentamente pipetear el exceso de líquido. Adhesión celular se puede aumentar el uso de poli-L-lisina cubreobjetos recubiertos.

ADN genómico no es completamente digerido. Para algunos tipos de células del paso DNasa I digestión posible que tenga que ser ampliada y / o el aumento de la concentración de DNasa I con el fin de lograr la eliminación completa del ADN genómico.

La fijación y artefactos de fraccionamiento. Es importante tener en cuenta que algunas proteínas pueden relocalizar durante la fijación o fraccionamiento ^6. Proteínas liberadas por la interrupción siguiente núcleo de la membrana nuclear, por ejemplo, puede obligar a los sitios que de otra manera estaría ubicado en compartimentos bien separados. Estos efectos pueden ser minimizados mediante la comparación de los resultados obtenidos utilizando diferentes métodos de fijación, por ejemplo, el uso de paraformaldehído en lugar de formol. Imágenes de células vivas también puede ser útil para las células de todo por lo menos ^3.

Esta técnica es muy adecuada para la detección de proteínas de fusión GFP. Sin embargo, es importante confirmar que la proteína de fusión se comporta de manera similar a la proteína sin etiqueta. También es importante confirmar mediante una valoración que las proteínas se expresan en niveles comparables, ya que la sobre-expresión de proteínas puede alterar dramáticamente sub-localización celular.

Aplicaciones de la técnica:

Esta técnica permite la localización de proteínas subutilizados que se determinará con referencia a los marcadores bien caracterizados de diferentes dominios o estructuras subcelulares y tiene aplicaciones en muchas áreas de la biología celular. Por ejemplo, muchos factores de transcripción muestra una distribución compleja con la localización en el citoplasma, nucleoplasma suelto y sujeto, la cromatina y / o la matriz nuclear ^1,2,4. Localización en cada uno de estos dominios pueden influir en la función de proteínas, así como la rotación de proteínas y modificaciones post-traduccionales.

Proteínas co-localización de áreas específicas tales como la matriz nuclear puede ayudar a comprender la función de proteínas. Proteínas re-localización en respuesta a señales específicas y / o la expresión de proteínas asociadas también pueden arrojar luz sobre la función de la proteína ^1,4.