Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos

I. Preparação para o fracionamento

Esta seção descreve a preparação de poli-L-Lisina lamínulas de microscópio revestidas eo anexo de células antes do fracionamento. Se necessário as células podem ser transitoriamente transfectadas com vetores de expressão de proteínas antes ou depois de apego.

A. Preparação de poli-L-Lisina lamínulas revestido

1. Prepare uma solução de 1mg/ml poli-L-Lisina em água destilada.
2. Lamínulas revestimento limpo com poli-L-Lisina, incubando-as na solução por pelo menos uma hora em uma plataforma de balanço a 22 ° C.
3. Lavar as lamelas revestido com água destilada estéril por duas vezes e seguir com uma única lavagem com etanol 96%.
4. Ar seco as lamelas revestido em um pedaço de papel de filtro e mantê-los em um recipiente seco para uso futuro (uma vez seca, eles podem ser empilhados).

Células B. Colocar em lamínulas

Células não aderentes (aqui usamos células K562)

1. Coloque uma lamela poli-L-Lisina revestido em um poço em um prato 6-bem com a superfície revestida voltada para cima.
2. Semente K562 células a uma densidade de 7x10 ⁵ células / poço em Modified Dulbecco Eagles Medium (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) e PS (penicilina 100units/ml, estreptomicina 100mg/ml). No caso de células K562 transfecção transiente pode ser realizada utilizando eletroporação (0,4 centímetros cubetas de eletroporação com 1x10 ⁷ células em 200μl dos meios de comunicação em 250V / 975μF) antes da semeadura das células.
3. Incubar as células por 24 horas a 37 ° C em 5% CO _2.
4. Deitar fora o meio e lave as células duas vezes com fosfato gelada solução salina tamponada (PBS).
5. Seguir com o protocolo de fracionamento subcelular.

Células aderentes (aqui usamos Cos-7 células)

1. Coloque uma lamela sem revestimento em um poço em uma placa de 6 poços.
2. Lavar duas vezes em PBS pré-aquecido a 37 ° C.
3. Separar as células por digestão com tripsina (0,03% EDTA, 0,25% de tripsina) em PBS a 37 ° C por 2-5 minutos. É importante não para mais de digerir as células e para parar a digestão, assim como predominantemente as células individuais flutuante estão presentes.
4. Parar a digestão semeando as células a uma densidade de 3x10 ⁵ células / poço em uma placa de 6 poços em DMEM suplementado com 10% FBS e PSG (penicilina 100 unidades / ml, estreptomicina 100ug/ml e L-glutamina 292ug/ml) , em lamínulas normal. Células aderentes geralmente atribuem bem em lamínulas de microscópio normal, no entanto, poli-L-Lisina lamínulas revestido pode ser usado se for necessário.
5. Incubar as células por 24 horas a 37 ° C e 5% CO _2. No caso da Cos-7 células transfecção transiente pode ser realizada utilizando Fugene 6 (Roche) se necessário, e as células da esquerda para a recuperação por mais 24 horas a 37 ° C e 5% de CO _2.
6. Deitar fora o meio e lave as células duas vezes com PBS gelado.
7. Seguir com o protocolo de fracionamento subcelular.

II. Fracionamento subcelular

Na fração situ é realizada de acordo com o esquema mostrado na Figura 1 e é baseado em um método descrito anteriormente ^5, com modificações descritas anteriormente ⁷ e no protocolo detalhado abaixo. É recomendado para transferir as lamelas de um prato 6-bem fresco após cada etapa de fracionamento de remover a lamínula antes de retirar o líquido. Embora apenas quatro lamelas são necessários para imagem, lamínulas adicionais são necessários para produzir extrato celular total e frações matriz nuclear para western blotting se isso é para ser realizado em paralelo.

1. Preparar e filtro citoesqueleto buffer (CSK): TUBOS 10mM, sacarose 300mM, NaCl 100mM, MgCl 3mM _2, 1 mM EGTA. CSK tampão deve ser preparada no dia do fracionamento.
2. Se necessário, a células de uma lamela pode ser usado para preparar um extracto de células inteiras de western blotting colocando delicadamente tampão 200ul TES (1% SDS, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl pH 7,4) diretamente sobre a lamela e incubar durante 1 ou 2 minutos a 22 ° C. O extrato de células inteiras podem então ser removidos e as proteínas precipitadas por adição de 250ul de 1M (NH ^{4) 2} SO ⁴ e incubar no gelo até a outras amostras ocidentais estão prontos.
3. Lavar as lamelas restantes com 1 ml gelada PBS duas vezes a 22 ° C pela inclinação do 6 bem-placa duas ou três vezes.
4. Retirar as lamelas representando células inteiras e transfira para um prato 6-bem fresco. Siga com a fixação das células e imuno-fluorescência protocolo.
5. Remova cuidadosamente a PBS dos poços restantes.
6. Extrair as proteínas citoplasmáticas e vagamente realizada nuclear colocando delicadamente tampão 200ul CSK + 0,1% (V / V) Triton X-100 diretamente em cada lamela restantes e incubação emgelo por 1 minuto.
7. Retirada do extrato citoplasmático e vagamente realizada nuclear e precipitar como descrito na etapa 2.
8. Lavar as lamelas com gelo 1ml frio PBS duas vezes a 22 ° C pela inclinação do 6 bem-placa.
9. Retirar as lamelas representando bem realizada material nuclear e siga com a fixação das células e imuno-fluorescência protocolo.
10. Remova cuidadosamente a PBS dos poços restantes em seguida, extrair as proteínas são mantidas em segredo colocando delicadamente tampão 200ul CSK + 0,5% (V / V) Triton X-100 diretamente em cada lamela restantes e incubar no gelo por 20 minutos.
11. Retirada do extrato são mantidas em segredo e precipitar como descrito na etapa 2.
12. Lavar as lamelas com gelo 1ml frio PBS duas vezes a 22 ° C pela inclinação do 6 bem-placa.
13. Retirar as lamelas representando fração cromatina e siga com a fixação das células e imuno-fluorescência protocolo.
14. Remova cuidadosamente a PBS dos poços restantes em seguida, coloque 200ul CSK tampão + 100ug/ml de DNase I para as lamelas restantes e incubar por 30 minutos a 37 ° C.
15. Retirada do extrato da cromatina e precipitar como descrito na etapa 2.
16. Lavar as lamelas com gelo frio PBS duas vezes a 22 ° C pela inclinação do 6 bem-placa.
17. Retirar as lamelas que representa a fração da matriz nuclear e siga com a fixação das células e imuno-fluorescência protocolo.
18. Se necessário, a proteínas da matriz pode ser removido de uma lamela matriz adicionais para western blotting utilizando tampão TES 200ul como descrito na etapa 2.
19. Amostras para western blot deve ser centrifugado a 13.000 rpm em microcentrífuga de bancada a 4 ° C e os sedimentos ressuspensos em 40ul SDS loading buffer (62,5 mm Tris-HCl pH 6,8, SDS 2% (w / v), 50 mM DTT, glicerol 10%, 0,01% de azul de bromofenol (w / v)) antes da análise por SDS-PAGE.
    
    Figura 1. A representação esquemática de no fracionamento subcelular situ. Citoesqueleto buffer (CSK) consiste em PIPES 10mM, sacarose 300mM, NaCl 100mM, MgCl 3mM _2, 1 mM EGTA. TES buffer consiste de 1% SDS, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl pH 7.4.

III. Fixação das células e imuno-fluorescência

1. Delicadamente adicionar 1 ml de formaldeído a 4% / PBS a cada lamela e incubar a 4 ° C por 30 minutos.
2. Lave cada lamela suavemente 2-3 vezes com 1ml de PBS a 22 ° C.
3. Adicionar 400ul de X-100/PBS Triton 0,1% a cada lamela e incubar a 22 ° C por 10 minutos.
4. Lave cada lamela suavemente 2-3 vezes com 1ml de PBS a 22 ° C.
5. Adicionar 400ul de 3% albumina sérica bovina (BSA) / PBS e incubar a 22 ° C por 20 minutos para reduzir a coloração de fundo em potencial.
6. Lave cada lamela suavemente 2-3 vezes com 1ml de PBS a 22 ° C.
7. 100ul lugar do anticorpo primário em PBS diretamente sobre a lamela e incubar a 22 ° C por 1 hora. Anticorpos primário e secundário deve ser diluído em PBS a concentração necessária. Este pode ter de ser otimizado para cada anticorpo utilizado.
8. Lave cada lamela suavemente 2-3 vezes com 1ml de PBS a 22 ° C.
9. 200ul local de anticorpo secundário em PBS e incubar a 22 ° C ao abrigo da luz por 1 hora.
10. Lave cada lamela suavemente 2-3 vezes com 1ml de PBS a 22 ° C.
11. Monte cada lamela (células para baixo) sobre uma lâmina de vidro usando Vectashield meio de montagem contendo DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole de cloridrato).
12. Limpe o excesso de meio de montagem de todo o lamela usando uma toalha de papel e incubar a lâmina a 22 ° C por pelo menos 30 minutos de distância da luz.
13. Fixar a lamínula para a lâmina de vidro utilizando unha polonês acrílico transparente.
14. Manter os slides longe da luz antes de visualização por microscopia de fluorescência.

IV. Resultados representativos

Figura 2. Fracionamento subcelular de não-transfectadas COS-7 células. Fracionado Cos-7 células foram fixadas com formaldeído e imunocoradas usando α-tubulina, α-histona H1 ou α-Lamin A anticorpos / C conjugada com TRITC seguido de tratamento com meio de montagem contendo DAPI . Imagens foram adquiridas com lente ocular de 10x e lente objetiva 63x usando um microscópio confocal Leica. Núcleos celulares foram visualizadas através de um conjunto de filtros DAPI, enquanto no mesmo campo células coradas com anticorpos marcador foram visualizadas através de um conjunto TRITC filtro.

Figura 3. A proteína de fusão GFP-6E2 é associado com a matriz nuclear. Fracionamento subcelular de Cos-7 células que expressam uma proteína de fusão composta de proteína verde fluorescente (GFP) fundida ao papilomavírus humano (HPV) do tipo 6E2 proteína (GFP-6E2). Núcleos celulares foram visualizadas através de coloração DAPI, enquanto localização de GFP-6E2 nas células transfectadas foi diretamente visualizadas através GFP fluorescência. Lamin A / C foi visualizado utilizando α-Lamin A anticorpos / C conjugada com TRITC e um conjunto TRITC filtro. As imagens revelam que alguns fusão da proteína GFP-6E2 é associado com a matriz nuclear (painel inferior direito). As imagens foram obtidas como descrito na Figura 2.

Problemas comuns e sugestões:

Todos ou a maioria das células são perdidas durante a lavagem. Durante as etapas de líquidos de lavagem deve ser adicionado lentamente para o lado do prato 6-bem evitando a lamela. Da mesma forma os líquidos devem ser retirados com cuidado a placa de inclinação e, lentamente, pipetagem off excesso de líquido. Adesão celular pode ser aumentada usando poli-L-Lisina lamínulas revestido.

DNA genômico não é completamente digerida. Para alguns tipos de células do DNAse passo digestão eu posso precisar de ser aumentada e / ou a concentração de DNAse eu aumentei a fim de alcançar a remoção completa do DNA genômico.

Fixação e artefatos de fracionamento. É importante notar que algumas proteínas podem relocalizar durante a fixação ou fraccionamento ^6. Proteínas liberadas a partir do rompimento seguintes núcleo da membrana nuclear, por exemplo, podem se ligar aos locais que poderiam ser localizadas em compartimentos bem separados. Estes efeitos podem ser minimizados, comparando os resultados obtidos utilizando diferentes métodos de fixação por exemplo, usando paraformaldeído no lugar de formaldeído. Imagens de células vivas também podem ser úteis para as células de todo, pelo menos, ^3.

Esta técnica é bem adequado para a detecção de proteínas de fusão GFP. No entanto, é importante para confirmar que a proteína de fusão se comporta de maneira semelhante à proteína não marcada. Também é importante confirmar por titulação que as proteínas são expressas em níveis comparáveis ​​desde a sobre-expressão da proteína pode alterar dramaticamente sub-celular de localização.

Aplicações da técnica:

Esta técnica permite subutilizados localização de proteínas a ser determinado com referência a marcadores bem caracterizados de diferentes domínios ou estruturas subcelulares e tem aplicações em diversas áreas da biologia celular. Por exemplo, muitos fatores de transcrição exibir uma distribuição complexa de localização para o citoplasma, nucleoplasma vagamente realizada, cromatina e / ou nuclear matriz ^1,2,4. Localização em cada um desses domínios podem influenciar a função da proteína, bem como volume de negócios de proteínas e modificações pós-translacionais.

Proteína co-localização para domínios específicos, tais como a matriz nuclear pode fornecer insights sobre a função da proteína. Proteínas re-localização em resposta a sinais específicos e / ou a expressão de proteínas parceiro também pode lançar luz sobre ^1,4 função da proteína.