Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Procedimentos detalhados de geração de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) de células de camundongo GFP-Olig2-tronco embrionárias (mESCs):

1. Rato linha celular ES GFP-Olig2 (G-Olig2), é comprado a partir do American Type Culture Collection (ATCC). O mESCs são rotineiramente várias passagens a cada 3 dias para uma camada de fibroblastos irradiados embrionárias de rato alimentador (MEF). As células MEF são banhados em 0,1% de gelatina revestido de seis bem placa de cultura de tecidos, pelo menos, um dia antes passaging CES. O meio de cultura MESC é meio modificado Dulbecco Águia (DMEM) (GIBCO) suplementado com 20% de soro fetal bovino (GIBCO), 2 mM L-glutamina, um piruvato de sódio mM, 0,1 mM β-mercaptoetanol /, 1% aminoácidos não essenciais ( NEAA), e 1.000 U / ml fator inibitório da leucemia.
2. colônias MES são tripsinizados (TrypLE, 5 min, 37 ° C) em células individuais e suspensas em knockout soro substituição médio (KSR), então as células são transferidas para um anexo Costar ultra-baixo de seis bem placa (Corning) em uma célula densidade de 50.000 células / cm ^2. Nessas condições, mESCs formar corpos embrióides (EBs). Médio KSR consiste de-minimal meio essencial (-MEM) suplementado com 20% KSR, piruvato de sódio 1 mM, NEAA 1% e 0,1 mM β-mercaptoetanol /.
3. Do dia 4 ao dia 7, ácido retinóico (RA, 0,2 M) e purmorphamine (Pur, 1 M) são incluídos como mostrado na figura. 1A em KSR ou médio N2. O meio é N2-MEM contendo 1X suplemento N2, piruvato de sódio 1 mM, NEAA 1% e 0,1 mM β-mercaptoetanol /. O meio é alterado todos os dias.
4. No dia 8, EBs são desagregados utilizando TrypLE (5min, 37 ° C) e semeadas em 0,01% polyornithine revestido pratos em OPC meio que consiste em N2 médio e fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2, 20 ng / ml). O meio é trocada a cada dois dias.
5. As células são tripsinizados (TrypLE, 3 min, 37 ° C) e replated aproximadamente a cada semana, quando eles se tornam confluentes. No dia 30, mais de 80% das células mostram GFP/Olig2 expressão e são NG2-positivos, característica de OPCs.
6. Para gerar OPCs spiking, o Na ⁺ BacMam canal kit é usado para introduzir Na _v 1.2 subunidade nestes OPCs MESC derivados. O reagente BacMam (1 ml componente, A) é misturado com PBS para um volume final de 5 ml. Então, o reagente BacMam mista é adicionado em MESC derivados cultura OPCs em um prato de cultura 60 mm (na confluência 50-70%) antes da lavagem com PBS. Após a incubação 2 hr, o reagente BacMam misto é removido e substituído por OPC meio suplementado com 1X enhancer. O enhancer é o componente B reconstituída em DMSO (componente C). Em seguida, após incubação 2 hr adicional de meio com enhancer é removido e substituído com o meio OPC completa. As células são analisadas 24 horas mais tarde.

Resultados representativos:

Seguindo o protocolo de diferenciação mostrado na figura. 1A, G-Olig2 mESCs foram inicialmente suspensos em meio KSR e para 4 dias para formar corpos embrióides (EBs) (Figura 1B). Então, tratadas seqüencialmente os EBs com AR e Pur. O EBS não apresentaram fluorescência da GFP no dia 4 e expressa de fluorescência da GFP forte em D8 (Figura 1B). Neste ponto do tempo, os EBs foram tripsinizados e banhado em meio suplementado com N2 fatores de crescimento FGF-2. Após o cultivo mais de 22 dias (D30), a porcentagem de células GFP + atingiu 80,3 ± 0,6%, de acordo com nossos resultados de citometria de fluxo. Como mostrado na figura. 1C, GFP + células sobrepostas com NG2 coloração consistente (96,4 ± 1,3% de células GFP positivas foram NG2 positivo, e 94,8 ± 1,5% de células positivas foram NG2 GFP positivas). Assim, estas células expressam GFP/Olig2 e NG2, definindo-os como OPCs.

O OPCs MESC derivados (76 células) falhou ao fogo potenciais de ação sobre a despolarização (Fig. 2A). Após transdução com um baculovírus carregando a subunidade Na _v 1.2, estes OPCs MESC derivados (94,1%, 16, de 17 células) poderiam ser classificados como spiking (Fig. 2B).

Figura 1. Diferenciação de GOlig-MESC em OPCs. Scheme (A) mostrando o protocolo do corpo embrióides (EB) e baseada em pequena molécula de diferenciação-driven. No D8, os EBs foram desagregados e banhados. As células foram várias passagens uma vez por semana, quando eles se tornaram confluentes. (B) D8, mas não D4 EBs, mostraram expressão GFP. (C) A imunocoloração de NG2 (vermelho) foi consistente com a GFP (verde) expressão em D30. DAPI (azul) foi utilizado para identificar os núcleos. Barra de escala: 20 mm.

Figura 2. Geração de OPCs spiking de nonspiking MESC derivados OPCs por vírus mediada Na expressão _v canal. (A) O potencial de membrana foi realizada a -60 mV e MESC derivados OPCs não conseguiu acionar os potenciais de ação, mesmo quando a célula foi despolarizada a 0 mV. (B) Um exemplo de MESC derivados OPCdisparo do potencial de ação (destaque em vermelho) após a transdução viral.

Células-tronco embrionárias (CES), isolado a partir de um embrião de blastocisto, podem se diferenciar em todas as linhagens de células do organismo ^{3, 4,} provendo uma in vitro sistema modelo para estudar o desenvolvimento de mamíferos adiantados, incluindo especificação de oligodendrócitos. mESCs foram mostrados para se diferenciar em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) com o tratamento de sonic hedgehog (Shh) ^5. Além disso, o Shh induzida diferenciação OPC a partir mESCs mantém o timing correto observado no desenvolvimento embrionário ^6. Assim, a natureza da diferenciação in vitro de mESCs OPC é considerado para ser coerente com o que foi aprendido com desenvolvimento in vivo. Aqui, usando a pequenas moléculas RA eo Pur agonista Shh, conseguimos diferenciada do mESCs G-Olig2 em GFP + + Olig2 NG2 + OPCs com alta eficiência.

OPCs, caracterizado pela expressão do proteoglicano NG2 ⁷ e do fator de transcrição hélice-alça-hélice Olig2 ^8, gerar oligodendrócitos no SNC em desenvolvimento e maduras, onde constituem uma percentagem significativa (~ 5%) do total de células e são os principal tipo de célula em proliferação ^9. Por quase duas décadas pesquisadores demonstraram Na canais _V são expressos em uma subpopulação de OPCs e pode ser activado a despolarização ^{10, 11.} Além disso, uma observação recente impressionante foi que em ⁹ no SNC de ratos situ substância branca, OPCs (~ 50%) gerados potenciais de ação quando despolarizada, dependendo da expressão de voltagem-dependentes de sódio (Na _V) canais, e, portanto, poderia ser subdividida em spiking e nonspiking subpopulações. No entanto, as funções dessas propriedades spiking são ainda desconhecidos. Descobrimos que, eletrofisiologicamente, o MESC OPCs derivados diferenciada com o protocolo Shh-dependente, não eram o mesmo que o cérebro em OPCs situ. Depois de introduzir subunidade Na _V 1.2, estas silêncio MESC derivados OPCs eram capazes de spiking.

Assim, o spiking / nonspiking MESC derivados OPCs e protocolo de diferenciação descrito aqui pode facilitar (1) estudar as diferenças funcionais entre spiking e nonspiking OPCs, (2) fatores de triagem novo que poderia promover a expressão dos canais de sódio na OPCs MESC derivados, ( 3) desenvolver e optimizar o protocolo de diferenciação de OPCs de humano ESC ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

Não há conflitos de interesse declarados.

Este trabalho foi em parte suportado por concessões para WD de National Institutes of Health (RO1 NS059043 e RO1 ES015988), Multiple Sclerosis Society Nacional, Fundação Roche para Anemia Research, Medical Foundation Feldstein, e os Hospitais Shriners para Crianças.

Gostaríamos de agradecer ao Dr. David Prazer e Jennifer Plane para sugestões. Declaramos a inexistência de interesses concorrentes relacionados para este artigo.

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2. Xian, H.Q., McNichols, E., St. Clair, A., Gottlieb, D.I. A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting. Stem Cells. 21(1), 41-9 (2003).
3. Evans, M.J. & Kaufman, M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292, 154-156 (1981).
4. Thomson, J.A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147 (1998).
5. Shin, S., Xue, H., Mattson, M.P. & Rao, M.S. Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells. Stem Cells Dev 16, 131-141 (2007).
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