In vivo Detektion av protein-protein interaktioner på mikro-mönstrade ytor

Microcontact utskrift:

1. Klipp ut område micropattern av PDMS stämpeln med skalpell
2. Tvätta fältet med micropattern genom att spola den med etanol (100%) och destillerat vatten.
3. Torka PDMS stämpel med kväve eller argongas.
4. Tillsätt 50 l BSA-Cy5 arbetet lösning (0,67 mg / ml) på PDMS stämpeln så att hela micropattern området är täckt med lösningen. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
5. Tvätta micropattern fältet genom att spola den med Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och destillerat vatten.
6. Torka PDMS med kväve eller argongas.
7. Placera PDMS stämpeln av sin egen vikt på mitten av en epoxihartsyta täckglas och inkubera i 30 minuter i rumstemperatur i en petriskål.
8. Etikett position PDMS stämpel på baksidan av täckglas och band stämpel från bilden med en pincett.
9. Stick ett säkert kammare Seal Hybridisering över microcontact tryckta fält på täckglas. Etiketten hjälper till att lokalisera mitten av fältet.
10. Pipettera 60 l streptavidin arbetet lösning (50 mikrogram / ml) i reaktionskammaren och inkubera provet i 60 minuter vid rumstemperatur.
11. Tvätta provet med 1 ml PBS genom att lägga till bufferten i en hamn i kammaren och ta bort den samtidigt på den andra porten med en pump.
12. Pipettera 60 l biotinylerad antikroppar arbetet lösning (10 mikrogram / ml i PBS kompletterad med 0,1% Tween 20, "PBST") i reaktionskammaren och inkubera i 60 minuter vid rumstemperatur.
13. Tvätta provet med 1 ml PBST och därefter 1 ml PBS genom att lägga till bufferten i en hamn i kammaren och ta bort den igen vid den andra porten med en pump.
14. Förvara micropatterned ytor i PBS i mörker vid rumstemperatur tills cellerna är redo för sådd.

Inkubation av celler på micropatterned yta:

1. Grow anhängare celler till 50% confluence i en 3 cm vävnadskultur plattan.
2. Lossa celler som uttrycker bete och bytesdjur proteiner av intresse med EDTA (etylendiamintetraättiksyra) lösning och centrifugera 5 min vid 1000 rpm.
3. Kassera supernatanten och lös cellpelleten i enlighet odlingsmedium.
4. Centrifugera 5 min vid 1000 rpm.
5. Kassera supernatanten och lös cellpelleten i lämpligt odlingsmedium.
6. Exchange PBS från reaktionskammaren på micropatterned täckglas med 60 l av cellsuspensionen.
7. Skapa en fuktig kammare genom att blötlägga en steril kompress i destillerat vatten och sätta det i petriskål för att förhindra att provet körs torr.
8. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C i en 5% CO ₂ atmosfären på micropatterned ytor.
9. Innan analysera cellerna i mikroskop, utbyte på medellång av Hank s buffrad saltlösning inklusive Ca ^{2 +} och Mg ^{2 +.}

Mikroskopi:

1. Den täckglas placeras på ett lämpligt fäste och cellmorfologin är markerat med vitt ljus.
2. Kvaliteten på BSA-Cy5 mönster kontrolleras av excitation vid 647 nm.
3. Micropatterns av fluorescerande byte protein (GFP eller YFP) bokförs 488 eller 514 nm under total inre reflektion (TIR) ​​excitation.

Representativa resultat:

Om det är samspelet mellan mål proteiner i celler som odlas på en micropatterned yta, kommer bytet att följa bete omfördelning. Den resulterande micropattern kan visualiseras genom fluorescens etikett byte protein. Viktigt kontrasten erhålls ger ett direkt mått på samspelet styrka (se figur 1). Därför är en enkel utvärdering av ett samspel mellan två proteiner blir möjligt - utan nödvändigheten av att ytterligare bearbeta de uppmätta primärdata.

Figur 1. Omdisponering av betet i den levande cellen plasmamembranet på olika samspel styrkor. TIR bilder av T24 celler transfekterade med (a) CD71-GFP på CD71-antikropp, (b) CD4 och cytosola YFP om CD4-antikropp och (c) GPI-GFP-DAF på CD59-antikroppar microbiochips visas. Uppgifterna är karakteristiska för stark (en), inget (b) eller svag växelverkan (c). (A) är hämtad från (Weghuber et al., In press), (b) från (Schwarzenbacher et al., 2008).

Den medföljande videon demonstrerar en metod för att upptäcka protein-protein interaktioner i plasma-membranet av levande celler (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). I princip kan alla TIRF-baserad mikroskopi plattform användas som avläsning system. Först när hög känslighet önskas (exempelvis för detektion av enstaka molekyler) kommer avancerade mikroskop krävas. För att uppnå bästa resultat följande kritiska punkter under förberedelseprocessen kräver särskild uppmärksamhet:

1. Förvara Cy5-stamlösning under mörka förhållanden för att undvika blekning av fluoroforen och förbereda BSA-Cy5 arbete lösningen friskt innan microcontact utskrift.
2. Var noga med att inte repa micropattern på PDMS med pipettspetsen och inkubera provet under mörka förhållanden för att undvika blekning av fluoroforen.
3. Sätt täckglas på en steril kompress för att förhindra fastnar på glaset glida åt petriskål. När PDMS stämpeln har anslutit sig till glasskiva, rör dig inte det.
4. Undvik luftbubblor i reaktionskammaren och inkubera provet under mörka förhållanden för att undvika blekning av fluoroforen.
5. Låt inte provet torka i mer än 2 minuter för att undvika att det bildas saltkristaller.
6. För att cellerna lossnar inte använda trypsin eftersom det kommer att klyva den extracellulära domänen av hittills uttryckt membranproteiner. Undvika trypsin kommer vara till hjälp för proteiner med låg omsättningshastighet för att bilda micropatterns omedelbart efter fastsättning av cellerna på ytan.
7. Styr antalet ruvade celler i mikroskop och se till att cellerna inte når mer än 30-50% sammanflödet. Se till att alltför celler tas ur omedelbart på grund av den snabba fastsättning av celler på antikroppsförsedda yta.
8. Endast bilder med hög kvalitet BSA-Cy5 mönster kan användas för vidare analys.
9. Stabil uttryck av fluorescerande byte protein är att föredra på grund av ökat antal celler som kan analyseras per skanning.
10. Adekvat TIRF justering är nödvändig för att visualisera mönster på grund av cytosoliska bakgrund.

Mikro-mönstring tekniken erbjuder flera möjligheter för analys av protein-protein interaktioner. För det första, tillsammans med kvantifiering av lokala, rumsligt upplösta protein-protein interaktioner också att upptäcka svag eller indirekt interaktion är möjlig utan nackdelen att ge ett stort antal falska positiva eller negativ. För det andra gör det möjligt för forskare att analysera protein-protein interaktioner i plasma-membranet av levande celler, som är svår att uppnå genom biokemiska metoder som 2-hybrid skärmen. För det tredje tillvägagångssättet möjliggör detektion av bete-byte interaktioner som moduleras av miljöförändringar såsom temperatur, förekomst av olika proteiner eller andra molekyler eller post-translationella modifieringar. Alltså analysen möjliggör screening modulatorer av en viss interaktion par i samband med levande celler. Dessutom, genom att minska ytan densitet fånga ligand eller användning av monovalent ligander, blir analysen av vilotillstånd möjligt. Slutligen, om tillräckliga skanning plattformar används, är antalet analyserade celler tillräckligt hög för att matcha hög genomströmning krav på läkemedelsföretag för narkotika screening (Ramm, 2005).

Videon innehåller bilder som erbjöds av Olympus, tagen från hemsidan för Visualisering Research Lab, Brown University eller återskapas från (Kim et al., 2003).

Vi vill tacka Quentina Beatty, universitetet i Linz, Österrike, för hennes vänliga hjälp, Katharina Strub, Universitetet i Genève, Schweiz, för hCD71-GFP konstruera, och Daniel Legler, University of Konstanz, Schweiz, för GPI-GFP -DAF konstruktion. Detta arbete stöddes av den österrikiska Science Fund (FWF, projekt Y250-B03) och GEN-AU projekt av Österrikes federala ministerium för vetenskap och forskning.

1. Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H. and Schuetz, G.J., 2009. Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments". Nat. Methods. 6, 183-184.
2. Kim, P.W., Sun, Z.J, Blacklow, S.C., Wagner, G., Eck, M.J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science 301, 1725-1728.
3. Ramm, P., 2005. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48.
4. Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H. and Schutz, G.J., 2008. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060.
5. Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H. and Schutz, G.J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology, in press.

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.