에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

다른 단계를 완료 프로토콜은 그림 1의 플로우 차트에 그려져 있습니다. 절개를 구성 각 단계는, RNA 추출, 첫 스트랜드 cDNA 합성과 qRT - PCR은 아래 내용입니다.

I. 애벌레의 해부

1. 이 절차의 시작, 장소 에메랄드 애쉬 송곳 또는 EAB, 젖은 티슈에 애벌레하기 전에 해부이 수행되기 전까지는. 신선한 1X 인산염은 절개를 통해 버퍼 추위를 유지하는 얼음, 또는 PBS, 생리 버퍼 유지.
2. 시작하려면, 미세 절개 핀과 해부 접시에 EAB 애벌레를 수정. 그 다음 해부 접시에 차가운 1X PBS를 추가합니다.
3. 첫째, 해부 가위의 벌금 쌍을 함께 애벌레 목을 벨. 이후 애벌레의 마지막 복부 세그먼트를 제거합니다.
4. 포셉의 시계 제조인 쌍을 사용하여 애벌레 시체에서 표피를 리프트. 그런 다음 가위를 사용하여 시체의 길이를 따라 절개합니다. 절개가 만들어으로 파열 창자를 안됩니다.
5. 조심스럽게 등 지방 기관 및 결합 조직 등 다른 조직에서 midgut 조직을 분리. 그런 다음, fatbody에 대한 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 신선한 1X PBS 버퍼에있는 조직을 씻어. 1.5 ML eppendorf 튜브에 미리 냉장 Trizol 시약 500 μL에 격리​​ midgut을 전송합니다.
6. 다음, 집게를 사용하여 지방 신체 조직을 분리하고 냉장 Trizol 시약 500 μL를 포함하는 1.5 ML eppendorf 튜브에 그것을 전송합니다.
7. 마지막으로, 조직 무결성을 손상하지 않도록 돌봐 모든 준수 조직을 scrapping하여 애벌레 시체의 표피 조직을 분리. 신선한 PBS 버퍼에 고립 표피 조직을 씻어 차게 Trizol 시약 500 μL와 1.5 ML eppendorf 튜브에 전송할 수 있습니다.
8. 절연 지방 몸, 표피 및 midgut 조직은 -80에 저장할 수 있습니다 ° C까지 RNA 추출은.
9. RNA 추출을위한 준비에서 발달 단계에 따라 다양한 EAB 샘플을 정렬합니다. 이러한 단계가 1 일, 2 -, 3 -,, 4 - instars, prepupae과 성인을 포함합니다.

II. RNA 추출 (Trizol 시약을 사용하는 제조 업체마다의 프로토콜로)

균질화

1. RNA 추출을 시작하려면 먼저 Trizol 포함 1.5 ML eppendorf 튜브에 조직을 균질로 플라스틱 pestles를 사용합니다. 균질 후, Trizol 시약 각 샘플의 to1 ML의 전체 볼륨을 가지고.
2. 발달 단계에 대한, 박격포와 유봉과 액체 질소로 전체 동물을 균질. 다음 Trizol 1 ML에 homogenate의 나누어지는 (50 μg)을 추가합니다.

단계 분리 :

3. 실온에서 15 분 동안 한 ML의 Trizol로 샘플 튜브를 품어.
4. 부화 후, 각각의 튜브에 클로로포름의 200μL를 추가합니다. 즉시 클로로포름을 추가한 후, 약 15 초 동안 적극적으로 튜브를 흔들. 그런 다음, 추가 2~3분을위한 실내 온도에서 튜브를 품어.
5. 다음, 2 ° C.에 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 원심 분리 후, RNA의 수성 단계있을 것입니다. 수성 단계의 볼륨을 600 μl, 또는 전체 Trizol 볼륨의 60 %되어야합니다.

RNA 침전

6. 조심스럽게만을 수성 단계를 제거합니다. 수성 단계 아래의 물질의 존재는 압축을 푼 RNA의 오염을 초래하게됩니다. 그런 다음, 적절하게 표시 1.5 ML eppendorf 튜브에 수성 단계를 전송합니다.
7. , 수성 단계에서 RNA를 침전 각 튜브에 이소 프로필 알코올의 0.5 ML를 섞어합니다. 10 분 상온에서 샘플을 품어. 부화 후 2 ° C. 10 분 12,000 XG에서 튜브를 원심 분리기

RNA 와시

8. 원심 분리 후, 튜브의 표면에 뜨는를 삭제. RNA는 튜브의 아래쪽에 형성 겔형 펠렛에 속해 있습니다. Trizol 1 ML 당 75 % 에탄올의 최소 1 ML 추가, 75 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. vortexing하여 섞는다. 그런 다음, 2 ° C.에서 5 분 7500Xg에서 튜브를 원심 분리기

RNA 용리

9. 튜브의 표면에 뜨는 폐기하십시오. 1 분 작은 테이블 원심 분리기에 다시 튜브를 원심 분리기. 주의 pipetting하여 관에서 초과 뜨는을 제거합니다. 튜브를 열어두고 50~10분을위한 펠릿 공기가 건조 보자. 이것은 크게는 용해도가 감소하므로 위에 펠릿 건조하지 않도록주의하십시오.
10. 공기 건조 후의 펠렛 resuspend diethylpyrocarbonate 또는 DEPC, 처리 물. 펠렛을 resuspend하는 데 사용되는 물의 양은 펠렛의 크기에 따라 달라집니다. SM에 대한 DEPC 처리 물의 50 μL를 사용하여큰 펠렛 모든 펠릿 또는 100 μL. 펠렛 완전히 여러 번 다운 피펫 팁을 이동하고하여 DEPC 처리된 물에 용해 보자.
11. 펠렛가 해산되면 10 분 동안 55 ° C에서 샘플을 넣으십시오.
12. 그런 다음, Nanodrop 분광 광도계 (RNA 샘플 2 μL)를 사용하여 각 RNA 샘플의 농도를 측정합니다.
13. -80에서 RNA 샘플을 보관 ° C 이상 사용까지.

III. 첫 스트랜드 cDNA 합성 (Invitrogen에서 윗첨자 첫번째 스트랜드 합성 키트를 사용하여 제조 업체마다의 프로토콜로.)

1. 각 RNA 샘플에 대해 PCR 튜브에 다음을 추가 :

   RNA	X μl
   10mM dNTP 혼합 M	1μl
   Oligo (DT) (0.5 μg / μl)	1 μl
   DEPC 물을 치료	(8 - X) μl
   총 볼륨 :	10 μl
   참고 : x는 cDNA 합성에 사용되는 RNA의 볼륨입니다. RNA의 농도에 따라 RNA로부터 2-3 μg 각 반응에 사용되며 각 반응의 총 부피 10 μl해야합니다.

2. 4 분간 65 thermocycler에 위의 반응 믹스 ° C를 놓습니다.
3. theromocyler에서 튜브를 제거하고 최소한 2 분 동안 즉시 얼음에 그들을 놓으십시오.
4. 다음을 추가하여 첫 스트랜드 마스터 믹스를 준비 :

   10X RT 버퍼	2μl
   25mM MgCl 2	4 μl
   0.1M DTT	2 μl
   RNase 아웃	1 μl

5. RNA 샘플을 포함하는 각각의 튜브, pipeting로 섞어 마스터 믹스 9 μl를 추가하고 혼합 잠시을 원심 분리기.
6. thermocycler에 다시 튜브를 삽입하고 42 ° C. 2 분 동안 품어
7. 일시 thermocycler를 각 튜브에 윗첨자 II 반대 transcriptase 효소 (Invitrogen) 1 μl를 추가합니다. 이 단계는 신속하게 완료되어야합니다.
8. 1.5 시간 동안 42 ° C에서 샘플을 품어.
9. 70 반응 ° C 15 분 동안을 종료할 수 있습니다.
10. thermocycler에서 튜브를 제거하고 얼음에 그들을 놓으십시오.
11. 각각의 튜브에 RNase H 1 μl를 추가하고 37 thermocycler에 다시 자리 ° C를 20 분.
12. thermocycler의 샘플을 복용 후, 각각의 튜브에 nuclease 무료 물을 20 μl를 추가합니다. 각 샘플의 볼륨이 단계에서 두 배가됩니다.
13. 샘플 2 μl를 사용하여 각 시료의 농도를 확인합니다. qRT - PCR에 사용하기 위해 20ng/μl의 농도를 만들기 위해 각 샘플의 나누어지는 가져가라. 20ng/μl의 농도에 샘플을 만들어 물의 양은 합성 cDNA의 초기 농도에 따라 달라집니다.

IV. qRT - PCR :

참조 유전자의 프라이머 설계 및 결정

1. 60 ° C와 ~ 100bp의 제품 크기의 녹는 온도 (TM)와 함께 디자인 primers.
2. AP - PERI1이 실험에 대한 관심의 유전자로 사용됩니다. 참조 유전자 또는 내부 통제는 데이터의 저장 분석과 정상화를 위해 필요합니다. Ribosomal 단백질 (AP - RP1)은 본 실험에 대한 참조 유전자로 사용됩니다.
3. 참조 유전자를 포함하는 데 사용됩니다 primers의 5uM 작업 주식을 준비합니다.

표준의 준비

4. 기준하여야한다 사용되는 primers의 효율성을 계산하기 위해서는.
5. 테스트하게 될 다양한 샘플로부터 cDNA를 혼합합니다.
6. 그래프의 각 원하는 포인트 5 배 시리얼 dilutions하십시오. 네 dilutions 충분해야하지만, 그 다섯도 매우 좋습니다.
7. 볼륨 얼마나 많은 지점과 얼마나 많은 기술 복제에서 사용중인 따라 달라집니다. 충분히 참조 유전자를 포함하여 테스트하고 각 유전자에 대한 표준을 만들기 위해이 있어야합니다.

플레이트 템플릿

8. qRT - PCR 플레이트의 각 잘 대해 샘플의 이름을 나타내는 템플릿을 디자인합니다. 각 유전자에 대한 기준과 적어도 두 기술은 샘플 당 복제를 포함하는 것을 잊지 말아주세요.

자전거 매개 변수를 설정

9. 에 qRT - PCR 기계를 켜고 자전거 매개 변수를 입력합니다. 다음과 같이 실험 자전거 매개 변수는 다음과 같습니다
   1 단계 :
   • 1 사이클 : 95 ° C 3 분
   2 단계 :
   • 40주기 : 95 ° C 15 초 60 ° C 30 초 뒤에
     (옵션 : 녹는 곡선을 결정하기위한 다음 단계를 포함)
   3 단계 :
   • 1 사이클 : 95 ° C 1 분
   4 단계 :
   • 1cycle : 55 ° C 1 분
   5 단계 :
   • 81주기 : 55 ° C 30 초

플레이트는 CFX96 (BioRad) 기계 설정

11. 별도의 튜브에서 각 유전자 (참조 유전자를 포함)에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 각 잘 들어, 마스터 혼합으로 구성되어 있습니다

    Nuclease 무료로 물	2μl
    2.5 X SYBR 녹색	4 μl
    앞으로 프리머	1 μl
    프라이머 역방향	1 μl
    총 부피	μl 8

12. 준비하는 동안 마스터 믹스 pipetting 오류에 대한 계정을 1-2 여분의 반응을 포함합니다.
13. 이전에 설계 템플릿에 따르면, 2 μL를 (20 μL / NG) 각 잘하는 cDNA의 추가할 수 있습니다. 그런 다음, 반응 당 10 μL의 총 볼륨의 결과, 각 잘하는 마스터 믹스 8 μL를 추가합니다.
14. 샘플 잘 혼합되어 있는지 확인까지 피펫 아래 (2 배). 어떤 액체가 끝에 숙박 없다는 것을 확인하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 각 샘플에 대한 새 팁을 사용합니다.
15. 전체 플레이트가 설치되면 광학 테이프로 번호판을 커버. 그리스의 존재가 읽기에 영향을 미칠 수 있으므로 테이프를 만지지 마십시오. 그런 다음, 우물의 모든 제품 판의 하단에되는 것을 보장하기 위해 1 분 500 RPM에서 번호판을 원심 분리기.
16. 원심 분리 후, 접시의 바닥에 얼음도 물도 없다는 것을 확인하십시오. 마지막으로, qRT - PCR 기계에있는 접시를 놓고 PCR 프로그램을 실행합니다.

실험의 V. 도표 표현

그림 1 : 플로우 차트는 유전자 발현 연구를위한 단계의 순서를 묘사.

그림 2 : 중간에 midgut를 보여주는) 애벌레 EAB의 해부. 애벌레 EAB의 B) 절연의 midgut

그림 3 : A) 표피 (잘라내기), midgut (MG) ​​및 지방 단체 (FB)를 포함해 다른 애벌레 조직에 peritrophin 유전자 (AP - PERI1)에 대한 상대적인 표현 값 (REVs) 의미합니다. EAB 특정 ribosomal 단백질은 (이하라는, AP - RP1) 관심의 유전자, AP - PERI1에 대해 얻은 데이터를 정규화에 대한 내부 통제로 사용되었다. 애벌레 조직에서 AP - PERI1의 B) 상대 배 변경할 수 있습니다. 표피 조직은 최소한 표현을 보여주 따라서 캘리 브 레이터 (1X) 샘플 (Pfaffl, 2001)로 찍은 거죠.

그림 4 : A) 애벌레 instars (제 1, 2, 3, 4), prepupae (PP)와 성인 (A)를 포함한 EAB의 다른 발달 단계에 peritrophin 유전자 (AP - PERI1)에 대한 상대적인 표현 값 (REVs) 의미합니다. EAB 특정 ribosomal 단백질 (AP - RP1)이 관심의 유전자, AP - PERI1에 대해 얻은 데이터를 정규화에 대한 내부 통제로 사용되었다. 다양한 발달 단계에서 AP - PERI1의 B) 상대 배 변경할 수 있습니다. PP 샘플은 mRNA 수준의 최소 수준을 보여주 따라서 캘리 브 레이터 (1X 샘플)로 찍은 거죠.

VI. 결론

정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 또한, qRT - PCR은 대부분 같은 microarrays 및 차세대 RNA - Seq으로 높은 처리량 유전자 발현 분석에서 생성된 데이터의 유효성을 검사하는 핵심 도구를했습니다.

임계값주기 (CT)이 값은 qRT - PCR 플레이트의 각 샘플에 대해 얻을 수 있습니다. 표준 곡선을 만들기위한 각 희석에 대해 얻은 CT 값은 그 농도의 로그 역모를 꾸몄다했다. 실험 샘플에 대한 CT 값은 다음이 희석 시리즈 표준 곡선에 꾸몄다했다. 목표 수량은 각 실험 즉, 조직 발달 표현에 대해 생성된 별도의 표준 곡선으로부터 계산되었다. 상대 표현식 값 (REVs) 다음 내부 통제를 위해 얻은 수량 (AP - RP1)와 관심의 대상 시퀀스의 수량을 (이 경우 AP - PERI1)를 나눔으로써 결정되었다. 중요성의 계산은 각 유전자에 대한 REVs의 로그는 SAS (SAS 연구소 주식 회사 SAS / STAT 사용자 안내서, 버전 9.1)의 PROC 혼합 절차를 사용하여 ANOVA (분산 분석)에 의해 분석되었다. 표현 수준에서 의의는 P <0.05로 결정되었다. 조직의 경우 상대 접어으로 변경되며, 변경된 사항은 캘리 브 레이터 (1X 샘플, Pfaffl, 2001)로 표피의 샘플을 복용하여 계산되었다. 따라서, midgut과 지방 기관의 표현 수준은 표피에 대한 상대했다. 발달 표현의 경우, prepupal 샘플은 캘리 브 레이터로 찍은 거죠. 두 연구, 두 생물은 복제 세 기술 복제가 사용되었습니다.

우리의 실험은 assayed 다른 조직에 비해 (P는 <0.05) 크게 midgut 조직에서 AP - PERI1 사본 높은 수준의 (그림 3) 밝혔다. 개발하는 동안 먹이 단계​​ (예 : 애벌레 instars와 어른) (P는 <0.05) 크게 prepupae 샘플 (그림 4) 이상했다. 이상의 mRNA 수준은 표피와 prepupae (Figs. 3 & 4) 계산했다. peritrophins 우리 결과 (Mittapalli 외가. 2007) 다른 곤충 종의 이전 연구 결과를 확증 곤충 midgut의 필수 구성 요소는 것을 감안할 때. 발달 단계 동안 관찰 패턴은 더욱 소화와 관련 프로세스 AP - PER1의 기능을 확인합니다. 농작물 식물에 널리 사용되는 바실 투린지엔시스 (BT) 독소 실제로 대상과 곤충의 오후 (Pauchet 외., 2009) 중단. 따라서, 본 연구에서 얻어진 결과는 EAB에 대한 잠재적인 제어 목표를 밝힐뿐만 아니라 곤충 종들은 새로운 환경에 적응하는 방법 침략에 대해서 기본 지식을 제공할 수 없습니다.