Cell elektrosvetsade visualiseras med fluorescensmikroskopi

I. Fylla celler med Cell trackers CMFDA och CMRA

1. Experiment utfördes på tidigare beredda celler mus melanom cellinje (B16-F1). Celler odlas i två separata 25 cm ² kulturen kolvar (TPP, ZDA) till 70-80% confluence i DMEM odlingssubstrat (Dulbecco ändrade Eagles medium) kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 0,15 mg / ml L-glutamin, 16 mg / ml gentamicin (alla från Sigma-Aldrich, Tyskland), 200 enheter / ml crystacillin (Pliva, Kroatien), och inkuberas i 5% CO ₂ vid 37 ° C.
2. Bered två 10 lösningar mM lager för cell-trackers (Invitrogen, USA) genom att lägga till 10,76 l och 9 l (för Grön CMFDA och för Orange CMRA respektive) av DMSO (Sigma-Aldrich, Tyskland) till 50 mikrogram av färgen i den ursprungliga Invitrogen flaskan. Beståndet lösning kan förvaras i kylskåp vid 4 ° C under några månader. Innan experimenten, värma upp lösningen tills kristaller av DMSO löses.
3. Förbered bikarbonat-fri Krebs-Hepes buffert (130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mm MgSO _4, 1,2 mm KH ₂ PO _4, 11,7 mm D-glukos, 1,3 mM CaCl _2, 10 mm HEPES, pH 7,4). I två 15 ml Eppendorf-rör blanda sig 2,1 l av varje stamlösning (10 mM CMFDA eller CMRA respektive) i 3 ml bikarbonat-fri Krebs-Hepes buffert. Detta ger en "loading lösning" som innehåller ca 7 mikroM CMFDA (eller CMRA).
4. Skölj cellerna två gånger med bikarbonat-fri Krebs-Hepes buffert och sedan infoga lastning lösningar i kolvarna. Inkubera cellerna i 30 minuter i 5% CO ₂ vid 37 ° C. Under denna första inkubationen reagenser passera fritt genom cellmembran, men väl inne i cellen, är reagenserna omvandlas till cell-impermeant fluorescerande reaktionsprodukter.
5. Efter första inkubation, skölj och inkubera celler med odlingsmedium i ytterligare två timmar i 5% CO ₂ vid 37 ° C.
6. Trypsinize celler i både kolvar (laddad med CMFDA och CMRA) och blanda röda och gröna celler tillsammans i ett förhållande 1:1 i ett 50 ml centrifugrör (TPP, ZDA). Justera cellkoncentrationen till 5 x 10 ⁶ celler / ml genom utspädning med DMEM medium eller koncentration med centrifugen. Placera en 20 l droppe cellsuspensionen i varje brunn på 24 multispot platta (TPP, ZDA). Inkubera cellerna i 5% CO ₂ vid 37 ° C i 20 minuter så att de kan lätt fäster på ytan av bra och etablera cell kontakter.

II. Elektrosvetsade

1. Förbered isoosomolar buffert kaliumfosfat (10 mM KH2PO4, 10 mm K ₂ HPO _4, 1mm MgCl _2, 250 mm sackaros) och hypoosmolar kalium fosfatbuffert (10 mM KH2PO4, 10 mm K ₂ HPO _4, 1mm MgCl _2, 75 mm sackaros) .
2. Placera multispot med celler på mikroskop scenen, placera elektroderna på botten av brunnen och ansluta dem till pulsgeneratorn.
3. Tvätta cellerna med 1 ml isoosomolar kaliumfosfat buffert. Tillsätt 350 ìl hypoosmolar kaliumfosfat buffert för att inducera cell svullnad. Bufferten bör omfatta elektroderna.
4. Lämna celler i hypoosmolar buffert i 2 minuter innan du applicerar elektriska pulser. Under denna tid inflöde av vatten molekyler in i celler på grund av osmotiska obalansen mellan insidan och utsidan av cellerna orsaka en ökning av cellens volym. Elektriska pulser bör tillämpas när celler är nära sin maximala volym, innan reglerande volymminskningen start.
5. För att uppnå optimal elektrosvetsning och bibehålla cellviabiliteten bör optimala parametrar för elektriska pulser användas. Dessa beror på cellinje som används [1]. I detta experiment ett tåg av 8 rektangulära pulser (vardera med längd 100 ìs vid 1 Hz) tillämpas på varje prov, med hjälp av elektroporation enhet (i vårt fall Cliniporator, IGEA, Italien). Pulserna levereras till två parallella Pt / Ir tråd elektroder med 0,8 mm diameter och 5 mm avstånd mellan dem och skapa ett elektriskt fält på ca 1200 V / cm mellan elektroderna i varje brunn, med undantag för kontrollen bra.
6. Låt cellerna ostört i 10 minuter efter puls leverans. Bestäm fusion avkastningen med hjälp av fluorescerande och fas kontrast mikroskopi.

III. Bild förvärv och bestämning av fusion avkastningen

1. Cellerna observeras med hjälp av en fluorescensmikroskop (i vårt fall Zeiss AxioVert 200, Zeiss, Tyskland) utrustad med ett mål (x20) och en kyld CCD-kamera (VisiCam 1280, Visitron, Tyskland). Bilderna förvärvas i metamorfa 7.1.1 (Molecular Devices, USA), men andra liknande förvärv programvara kan också användas. CMFDA är glada med en monokromator (polykrom IV, Visitron, Tyskland) vid 492 nm och CMRA på 548 nm. Den fluorescens CMFDA och CMRA förvärvas med hjälp av två utsläpp filter, en centrerad vid 535 nm (HQ535/30m för CMFDA) och den andra centrerade vid 510 nm (D605/55m, för CMRA, både Chroma, USA). Användningen av dikroiskt spegel (Q515LP) hindrade prata kanalen korset.
2. Förvärva tre bilder (faskontrast, röd och grön fluorescens) i fem slumpvis utvalda fält i varje brunn. Skapa tre kanal bilder från varje bild triplett. I en sådan bild fluorescerande cytoplasman kan ses tillsammans med cellmembranen. Brända celler kan därför lätt fastställas [Figur 1].
3. Räkna alla tre typer av celler (röd, grön och för sig fluorescerande) i varje tre-kanal bild. Bestäm andelen för sig fluorescerande celler genom att dividera antalet för sig fluorescerande celler med antalet alla celler i varje bild. Fusion avkastningen definieras som den andel av för sig fluorescerande celler multipliceras med 2 eftersom hälften av smält celler inte upptäcks (när celler av samma färg säkring).

Representativa resultat

Figur 1 Tre kanal mikroskopi bild av B16F1 celler efter elektrosvetsning:. Faskontrast, CMRA fluorescens (excitation vid 548 nm) och CMFDA fluorescens (excitation vid 492 nm), objektiv förstoring 20x

Förmåga cellmembran att smälta icke-specifikt, t.ex. av yttre elektriska fält, är viktigt för bioteknik, medicin och forskning inom biologi. Sådana ospecifik fusion möjliggör produktion av mycket värdefulla hybrid celler och deras produkter, såsom monoklonala antikroppar, och ger information om grundläggande mekanismer för fusionsenergi [2]. Elektrosvetsade är en potentiellt mycket effektiv metod eftersom det kan vara rätt anpassas till olika typer av celler. Elektrosvetsade uppnås när celler i nära fysisk kontakt förs in i deras fusogenic tillstånd (som lätt kan fusion) med hjälp av högspänd elektriska pulser. Effektiviteten i elektrosvetsning beror på olika parametrar som påverkar två delar av elektrosvetsning processen. Första delen av elektrosvetsning processen är uppnåendet av nära fysisk kontakt mellan celler, som kan erhållas med olika metoder [3-8]. Respekt metoden (växande celler till sammanflödet) kan användas effektivt på grund av spontant etablerade cellkontakter i stora zoner mellan cellerna, men ger det mycket stora smält celler med många kärnor. Vi använder den modifierade följsamhet metoden, där mindre celler (med 2 till 5 kärnor), vilka är mer benägna att överleva och föröka sig, erhålls (figur 1). Kontakt mellan celler drar också nytta osmotisk svullnad av celler, på grund av osmotiska behandling som används i försöket [9]. Andra delen av elektrosvetsning processen är att uppnå fusogenic tillståndet i cellmembranen. Fusogenic staten korrelerar väl med electropermeabilized tillstånd av membranet (celler ospecifikt permeabilized att molekyler som normalt inte kan passera genom intakt membran) och styrs av samma parametrar i elektriska pulser (amplitud, längd, antal och frekvens) [10] . Värdena för elektriska parametrar som behövs för optimal elektroporation [1] och elektrosvetsning skiljer sig mellan olika celler och är beroende av celler storlek och deras biologiska egenskaper. Elektriska parametrar måste därför vara optimerade för olika cellinjer, som används som fusion partner, för att få fusion.

Inga intressekonflikter deklareras.

Detta arbete stöddes av det slovenska forskningsinstitut (projekt J2-9764 och program P2-0249). Denna video är kompletterande material för "elektroporation-baserade tekniker och behandlingar" vetenskapliga verkstad och magisterexamen, som anordnas av fakulteten för elektroteknik vid universitetet i Ljubljana, Slovenien.

1. Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N.A., Serša, G. Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro. Electro. Magnetobiol 17, 263-272 (1998).
2. Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., šprohar, M., Miklavčič, D. Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells. Bioelectrochemistry 74, 124-129 (2008).
3. Rols, M.-P. and Teissié, J. Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure. Biochemistry 29, 4561-4567 (1990).
4. Neil, G. and Zimmermann, U. Electrofusion. in Methods in Enzymology, vol.220, p.174-196
   Abidor, I.G., Li, L.-H., Hui, S.W. Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions. Biophysical journal 67, 427-435 (1994).
5. Jaroszeski, M.J., Gilbert, R., Fallon, P.G., Heller, R. Mechanically facilitated cell-cell electrofusion. Biophys J. 67(4), 1574-1581 (1994).
6. Ramos, C., Bonefant, D., Teissié J. Cell hybridization by electrofusion on filters. Analytical biochemistry 302, 213-219 (2002).
7. Cao, Y., Yang, J., Yin, Z.Q., et al. Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip. Microfluid Nanofluid 5, 669-675 (2008).
8. Ušaj, M., Trontelj, K., Kandušer, M., Miklavčič, D. Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization. Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).
9. Teissié, J. and Ramos, C. Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes. Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).

1 Comment

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.