Системное и местное доставки лекарств для лечения заболеваний центральной нервной системы у грызунов Модели

Serwer, L., Hashizume, R., Ozawa, T., James, C. D. Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models. J. Vis. Exp. (42), e1992, doi:10.3791/1992 (2010).

Тщательное доклинические испытания центральной нервной системы (ЦНС) терапия включает в себя рассмотрение способов их применения и агент биораспределения при оценке терапевтической эффективности. Между двумя основными классификациями управления, местного против системного, системные подходы доставки часто предпочитают за счет простоты управления. Тем не менее, системной доставки может привести к нерациональному концентрация препарата достигается в центральной нервной системе и привести к ошибочным выводам в отношении агента эффективности. Локальные методы доставки лекарственных средств более агрессивны, но могут быть необходимы для достижения терапевтического препарата ЦНС уровнях. Здесь мы демонстрируем правильной техники в течение трех маршрутов системной доставки наркотиков: внутривенные инъекции, при введении препарата, а также устные желудочный зонд. Кроме того, мы покажем метод для локальной доставки в мозг: конвекция повышенной доставки (КНИ). Использование флуоресцентно-меченых соединений включена для прижизненного изображения и проверки надлежащего отправления наркотиков. Методы представлены с использованием мышиных моделей, но могут быть легко адаптированы для использования в крыс.

1. Системная Способы доставки

Хотя системной доставки наркотиков не является наиболее эффективным подходом для достижения высокой концентрации препарата в ЦНС, системные поставки удобны и хорошо принимаются пациентами. Здесь мы покажем, надлежащих процедур в течение трех обычно используются системные подходы администрации: внутривенные инъекции, при введении препарата, а также устные желудочный зонд.

А. Внутривенные инъекции (инъекции хвостовую вену)

1. Перед началом процедуры, массы тела каждой мыши должны быть зарегистрированы. Как и все доклинические исследования, масса тела должна контролироваться регулярно (дважды в неделю или больше) для оценки потенциальной токсичности препарата. Не более 1% от массы тела мыши в объеме следует вводить за один раз. Например, не более 0,2 мл жидкости должны быть введены в 20g мыши. Все растворы вводят внутривенно следует стерилизовать соответствующий метод.
2. Мыши должны быть прогреты в течение 5-10 минут, используя либо грелку или тепла лампы, чтобы расширить хвостовую вену. При использовании тепла ламп, монитора мыши в любое время, чтобы избежать гипертермии.
3. Мышь переходит к проведению устройство, которое сдерживает мыши, обеспечивая доступ к хвостовой вены (см. видео). В мышке хвост Есть четыре видимых сосудов: сосуды на спинной и боковых сторонах вены, и судно на брюшной стороне артерии. Чтобы получить доступ к хвостовой вены, хвост мыши проводится в наиболее дистальной точке, и поворачивается на 90 градусов так, что вены вверх. Инъекции очищается спиртом и 28 г шприц инсулина вводится, скошенные стороной вверх, в вену (см. видео). Если игла правильно расположенных в вену, он должен двигаться свободно и без давления. Медленно вводить препарат с равномерное давление в течение 5-10 секунд. Если волдырь появляется на хвост, остановить закачку, так как это означает, что игла не в вене.
4. После инъекции применять мягкое давление в месте инъекции до остановки кровотечения. Это обычно занимает 30-60 секунд. Монитор мыши в течение 5-10 минут после инъекции, чтобы гарантировать, что нет никакого дальнейшего кровотечения.

Б. внутрибрюшинного введения

1. Перед началом инъекции, препарат должен быть загружен в шприц прилагается к 28g иглы. Убедитесь, что есть место в шприце для рисования поршень до инъекции (например, если инъекционных 200 мкл, убедитесь, что шприц мощностью 300 мкл и выше).
2. Удалить мыши из клетки за хвост и поместите его на текстурированной поверхности, так что мышь имеет некоторое отношение к рукоятке. Клетке крышкой, как правило, достаточно. Разрешить мыши растягивать свое тело, а затем с помощью не доминантной рукой возьмитесь за кожу на спине мыши, заботясь, чтобы слегка ущипнуть, как много кожи возможно между большим и указательным и средним пальцами (см. видео). Включите курсор так, чтобы живот мышь вверх. Если мышь может свободно двигать головой, отпустите сцепление и попробуйте еще раз, чтобы избежать укуса во время инъекции.
3. С Вашей доминирующей рукой, поднимите шприц и вставить иглу в 30 градусов в левом нижнем квадранте мыши (см. видео). Холдинг мыши слегка перевернутой поможет поднять органов от укола. Чтобы убедиться, что игла находится в внутрибрюшинного пространства, потяните на себя поршень шприца. Если какой-либо жидкости или крови появляется в шприц, затем игла не находится в внутрибрюшинного пространства и должна быть удалена. Если нет жидкость всасывается в шприц, а затем вводят шприцем содержимое даже давления на 1-5 секунд и отпустите кнопку мыши.
4. Монитор мыши в течение 5-10 минут после инъекции, чтобы мышь возвращается к нормальному уровню активности.

С. Устные зонд

1. Перед началом инъекций, записывать вес мыши. Максимальный объем, который может быть доставлен по устным зонд является 10 мл на килограмм массы тела. Например, максимальный объем для 20g мыши будет 200 мкл. Попытка придать больший объем может привести к рефлюкс, что приведет к неполной доставки лекарств. Если необходимо администрировать объемах, чем указано выше, по меньшей мере три дозы могут быть введены в течение 24 часов.
2. Чтобы избежать проколов пищевода, важно, чтобы измерить длину зонда иглы для каждой мыши. Держите кончик 18g мяч изогнутыми зонд иглы в последние ребра мыши, а затем знак длины на кончике голову мыши, используя маркер (см. видео). Во время принудительного кормления, то этот знак будет точка остановки, как вы вставить иглу в устье мыши.
3. Сдерживайте мыши, используя тот же ручка, как для внутрибрюшинного введения. Вставьте зонд иглу в рот, за язык, и ADVANCE иглу через глотку. Не вставляйте иглу прошлом остановки знака. Игла должна проходить гладко, без какого-либо давления (см. видео). Если вы столкнулись с давлением, остановить и вывести иглу, чтобы избежать инъекционного жидкости в легкие.
4. С иглу на месте, нажмите поршень более 1-5 секунд, а затем удалить иглу под тем же углом, что он вставлен. Монитор мыши в течение 5-10 минут, обращая особое внимание на любые признаки затрудненного дыхания, которые могут указывать, что жидкость вошла легких.

2. Местной Доставки

Острый Конвекция-Enhanced доставки

А. Зонд Строительство

Рефлюкс-устойчивые КНИ канюли для грызунов еще не на коммерческой основе. Здесь мы продемонстрируем метод построения канюля, которая была адаптирована из метода впервые описана Краузе и др. (Краузе 2005).

• Канюля состоит из трех частей (рис. 1): 100 мкм трубки кремнезема диаметром, через которые инфузата потоков, жесткие иглы металла для структурной поддержки и гибкие трубки Тефлоновые для загрузки инфузата.
• Чтобы получить жесткую иглу металла, использовать открытый огонь, чтобы расплавить пластик на катетер Surflo IV (24g стилет) и с помощью пинцета удалите металлической иглы. Остальные катетер может быть удален. Сокращение длины трубы кремнезема (OD 0.163mm), немного дольше, чем металлическая игла, с помощью всего одного края лезвия бритвы. Роль кремния труб в небольшую каплю цианоакрилат основан быстродействующий клей (например, Krazy Glue), заботясь, чтобы не получить любой клей на концах трубы. Вставьте кремнезема труб в металлической иглы и дайте высохнуть в течение 5 минут.
• После высыхания, кремния трубки должны быть прочно прикреплены к игле. Концы кремния должны быть обрезаны так, что 2 мм кремнезема трубки выступает из заостренный конец иглы и 3 мм кремнезема трубки выступает из плоским концом (см. видео).
• Вырезать часть тефлоновой трубки 20 см в длину. Рулон металлической иглы в небольшую каплю клея, снова стараясь не получить клея на концах трубки кремния, поскольку это будет забивать канюли. Вставьте иглу в трубки Тефлоновые на глубину до 1 см. Дайте высохнуть в течение 1 минуты. Использование клей пистолет, нанесите каплю горячего клея для соединения между иглой металл и трубы тефлон (см. видео). Убедитесь, что все совместные покрыта со всех сторон и дать высохнуть в течение по крайней мере 1 час. Канюли могут быть сделаны до недели заранее и хранить при комнатной температуре.

Б. Процедура инфузии

• Для подготовки хирургической области, все поверхности должны быть распылены с дезинфицирующим средством, например, 2% раствором хлоргексидина. Стерильные хирургические перчатки во время процедуры. Поверхность покрывается абсорбирующего шторы. Следующие поставки должен быть помещен в хирургическое площадь:
  • Грелки для поддержания температуры тела мыши
  • Два маленьких чашках Петри, один, содержащий 3% перекиси водорода, а один, содержащий 2% хлоргексидина
  • Стерильные тампоны марли и хлопка
  • Стерильные одноразовые скальпели (номер 21)
  • Стерильные 22g иглы
  • Мышь стереотаксической кадра
  • Контролируемая скорость насоса шприца
  • Автоклавного кожи мыши степлер, скобы, и основным для удаления
• Для настройки КНИ канюли, приложите 1 мл шприц, чтобы трубка тефлон с помощью набора пластиковых адаптеров шприц. Канюли должны быть прикреплены к стереотаксической кадр так, чтобы она была перпендикулярна к хирургическому поверхности (см. видео). Для дезинфекции канюли, заполнить шприц 1 мл 70% этанола и нажмите поршень для запуска этанола через канюлю. Повторите этот процесс с помощью стерильного физиологического раствора, и проверить на наличие течи вокруг суставов канюли. Для дезинфекции вне канюли, аккуратно протрите 70% этанола салфеткой.
• Заполните канюли стерильным физиологическим раствором, а затем потяните на шприц так, чтобы небольшой пузырек воздуха втягивается в канюлю. Этот воздушный пузырь будет отдельный инфузата от физиологического раствора в канюлю. Затем, backload ваш инфузата (см. видео). Подключите шприц насос шприца и премьер-насос, работающий кратко канюли.
• Седативный мыши, используя инъекции обезболивающего и подготовить кожу моечные несколько раз (в течение 5-10 секунд) с кусочком стерильной марли, смоченной в 2% раствором хлоргексидина. Офтальмология мазь следует наносить на мыши для поддержания адекватного уровня влажности во время процедуры. Используя стерильный скальпель, создать сагиттальный разрез по центру черепа, около 1,5 см длиной (см. видео). Поверхности черепа, затем очистить с помощью ватного тампона, смоченной в 3% раствором перекиси водорода. Будьте осторожны, чтобы избежать попадания перекиси водорода в глазах мыши. Шва линии черепа должно быть очевидно, на данный момент: если они не видны, мягко тампоном череп с фрэш ватный тампон, пропитанный 3% раствором перекиси водорода.
• Определить брегмы (рис. 2), а затем измеряют 2 мм до 1 мм справа и задний этой структуры, чтобы найти месте инфузии. Использование стерильной иглой 22g, мягко создать отверстие в черепе, в этот момент, повернув иглу против черепа (см. видео). Избегайте воздействия иглой вниз от черепа.
• На данный момент, мыши должны быть помещены в стереотаксической рамы и начать получать вдыхании анестезии (см. видео). Администрирование анестезии на низком уровне (1%), а также тщательно следить за мышь для изменения в частоте дыхания, регулируя анестезии соответственно.
• Позиция канюля за череп отверстие и опустите 3 мм ниже поверхности черепа. Начните инфузии, используя следующие ставки и длительности:

  0,1 мкл / мин в течение 5 минут
  0,2 мкл / мин в течение 5 минут
  0,5 мкл / мин в течение 5 минут
  0,8 мкл / мин в течение 7,5 минут
  OFF в течение 1 минуты

• В конце инфузии, медленно извлеките канюлю и тампоном, череп с 3% перекисью водорода. Применить стерильный воска кости отверстие (см. видео). Использование щипцов, рисовать кожу вместе над черепом и основных закрыть. Бупренорфин следует назначать для послеоперационного обезболивания.
• Монитор мыши после операции, пока не приходит в сознание и подвижность. Из-за продолжительности процедуры, она может занять до часа для мыши, чтобы восстановить полноценную работу. За это время место мыши клетку на грелку, чтобы избежать переохлаждения, а не дома восстановления мыши с другими активными мышей.
• Кожа скобы должны быть удалены через неделю после операции.

С. В Vivo изображений

Флуоресцентно меченных инфузата могут быть отображены следующие КНИ администрации, и может следить за изменениями в интенсивности сигнала, а также сигнал месте. Как правило, лучше подождать 2-3 часа после инфузии на изображение, с тем чтобы мыши, чтобы оправиться от вливания.

• Для обезболивания во время съемки, используйте низкий уровень вдыхания анестетика. Поместите мышь, спинной стороной вверх, в станцию ​​визуализации (например, ИВИС Lumina, суппорт Life Sciences, Аламеда, штат Калифорния). Использование соответствующего фильтра настройки для фтора, что в настоящее время отображаемого, приобретать изображения. Для КНИ, успешный вливания должны показать большую часть материала в мозге возле месте инфузии (рис. 3).

3. Представитель Результаты

Отсутствие побочных реакций на введение терапия является важным показателем успешной инъекции. Например, после инъекции вены хвоста не должно быть никаких изменений внешнего вида (например, размер, цвет) хвост. Пузыря или волдыря следующие хвост инъекции вены будет означать подкожно, а не внутривенно, доставка терапии. Для внутрибрюшинного введения, шишка на коже или обесцвечивание живот может указывать на подкожные инъекции или повреждения внутренних структур. В устной желудочный зонд, мышь с затрудненное дыхание или кашель могут свидетельствовать, что жидкость вводили в легкие, а не в желудке.

Для КНИ, неврологических функций важно для оценки успешное управление терапии. Мышь, которая проявляет судороги или гемипарез, возможно, получили неправильное инфузии. Если флуоресцентные инфузата используется, в естественных изображений может быть применена для оценки успешного управления (рис. 3). Если инфузата не локализуется в месте инъекции, инфузии не увенчалась успехом.

Рисунок 1: CED канюля и хирургической установки. Основными элементами конвекции-повысить результативность хирургической настройки отображаются. Microinfusion насоса () прилагается к инфузии канюля (Б, как показано увеличены на вершине). Стереотаксической рамы (C) используется для позиционирования зонда. Этот образ не включают отопление и анестезиологическое оборудование также используется во время процедуры.

Рисунок 2: Мышь Линии черепа швов. КНИ сайт инфузии (красная звезда) могут быть расположены путем выявления пересечения сагиттальной и корональной швов (брегмы), а затем измерения 2 мм боковой и задней 1 мм в темя.

Рисунок 3: Представитель Результаты успешного КНИ. Liposomes помечены дальнего красного флуоресцентного красителя вводились в мозг мыши по КНИ и отображаемого как в естественных условиях и бывших естественных условиях. Успешное вливание показывает, флуоресцентный сигнал локализован в месте инфузии, как в естественных условиях (А) и экс естественных условиях (B). Сигнал должен быть локализован в инфузии полушарии, не допуская утечки в контралатерального полушария.

Рисунок 4: представитель Изображение успешных КНИ в Крыса мозга. Флуоресцентно меченных липосом были проникнуты в крысу мозга. У крыс, столько, сколько 20 мкл могут вводиться. Увеличилась толщина черепа крысы и глубину инъекции исключается в естественных изображений, но и правильное расположение вливания могут быть проверены, бывшим визуализации естественных условиях из расчлененного мозга.

Доклинические оценки эффективности любого терапевтического средства необходимо учитывать фармакологические свойства агента и ткани-мишени, представляющих интерес. Хотя системные методы управления в целом более поверхностным и лучше переносится пациентами, селективность гематоэнцефалический барьер зачастую требует локальной доставки терапии для лечения нервной болезни. Здесь мы продемонстрировали один метод прямой доставки к мозгу: КНИ. Другие виды локальной доставки в мозг включать в себя прямые администрации спинномозговой жидкости, внутриопухолевого введения болюса, и желудочковой инъекции. Для этих методов диффузионной терапевтических является критически важным, с плохой диффузии, ограничивающие область охвата в нескольких миллиметрах от места инъекции (Jain 1989, Бобо 1994). В отличие от этого, КНИ использует положительное давление для увеличения площади распространения наркотиков (Бобо 1994), в то же время позволяет терапевтических ориентации на конкретные нейроанатомической структур. В нашей лаборатории мы успешно выполнена КНИ в стволе мозга, а также в хвостатое путамен у грызунов (рис. 4).

Способность вести КНИ у грызунов моделей становится все более важной в связи с ростом интереса к максимальной терапевтической эффективностью при лечении различных видов заболеваний ЦНС. КНИ могут быть использованы для доставки разнообразных агентов, в том числе очищенных белков, небольшие молекулы наркотиков и вирусов (Gill 2003, Degen 2003, Szerlip 2007). Спектр болезней, которые можно лечить с помощью СЭД включает в себя рак ЦНС (Yamashita 2007), а также нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона (Gill, 2003). Как КНИ исследования продолжает расширяться, необходимость в естественных изображений КНИ вводить терапии так же увеличивается. Хотя флуоресцентные изображения продемонстрировали здесь, скорее всего, не будут видны через человеческий череп, другие методы использования совместно вливание MRI контрастных средств (Dickinson 2008) привлекают интерес для оценки применимости для мониторинга infusates у пациентов с болезнью ЦНС.

Все процедуры, продемонстрировали здесь были утверждены UCSF Институциональные уходу и использованию животных комитета.

NS65819 (CDJ, К), NS049720 (CDJ), CA097257 (CDJ, К), CIRM DR1-01426
Мы хотели бы поблагодарить Ракель Сантос на техническую помощь.

1. Bobo, R.H., Laske, D.W., Akbasak, A., Morrison, P.F., Dedrick, R.L., Oldfield, E.H. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2076-2080 (1994).
2. Degen, J.W., Walbridge, S., Vortmeyer, A.O., Oldfield, E.H., Lonser, R.R. Safety and efficacy of convection-enhanced delivery of gemcitabine or carboplatin in a malignant glioma model in rats. J Neurosurg, 99, 893-898 (2003).
3. Dickinson, P.J., LeCouteur, R.A., Higgins, R.J., Bringas, J.R., Roberts, B., Larson, R.F., Yamashita, Y., Krauze, M.T., Noble, C.O., Drummond, D.C., Kirpotin, D.B., Park, J.W., Berger, M.S., Bankiewicz, K.S. Canine model of convection-enhanced delivery of liposomes containing CPT-11 monitored with real-time magnentic resonance imaging: laboratory investigation. J Neurosurg, 108, 989-998 (2008).
4. Gill, S.S., Patel, N.K., Hotton, G.R., O'Sullivan, K., McCarter, R., Bunnage, M., Brooks, D.J., Svendsen, C.N., Heywood, P. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nature Medicine, 9, 589-595 (2003).
5. Jain, R.K. Delivery of novel therapeutic agents in tumors: physiological barriers and strategies. J Natl Cancer Inst., 81, 570-576 (1989).
6. Krauze, M.T. Saito, R. Noble, C.O., Tamas, M., Bringas, J., Park, J.W., Berger, M.S., Bankiewicz, K. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. J Neurosurg, 103, 923-929 (2005).
7. Krauze, M.T., Vandenberg, S.R., Yamashita, Y., Saito, R., Forsayeth, J., Noble, C.O., Park, J.W., Bankiewicz, K. Safety of real-time convection-enhanced delivery of liposomes to primate brain: a long-term retrospective. Exp Neurol, 210, 638-644 (2008).
8. Murad, G.J., Walbridge, S., Morrison, P.F., Garmestani, K., Degen, J.W., Brechbiel, M.W., Oldfield, E.H., Lonser, R.R. Real-time, image-guided, convection-enhanced delivery of interleukin 13 bound to pseudomonas exotoxin. Clin Cancer Res,. 12, 3145-3151(2006).
9. Ozawa, T. and James, C.D. Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models, in CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches (Van Meir E, ed.), pp. 147-162, Humana Press-Springer, New York, NY, 2009.
10. Szerlip, N.J., Walbridge, S., Yang, L., Morrison, P.F., Degen, J.W., Jarrell, S.T., Kouri, J., Kerr, P.B., Kotin, R., Oldfield, E.H., Lonser, R.R., Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles. J Neurosurg, 107, 560-567 (2007).
11. UCSF IACUC Standard Procedures http://www.iacuc.ucsf.edu/Policies/awStandardProcedures.asp Accessed January 8, 2010.
12. Yamashita, Y., Krauze, M.T., Kawaguchi, T., Noble, C.O., Drummond, D.C., Park, J.W., Bankiewicz, K.S. Convection-enhanced delivery of a topoisomerase I inhibitor (nanoliposomal topotecan) and a topoisomerase II inhibitor (pegylated liposomal doxorubicin) in intracranial brain tumor xenografts. Neuro Oncol, 9,20-28 (2007).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.