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स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

, ,

Department of Biology, University of Rochester

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Cite this Article: स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (43), e2002, doi:10.3791/2002 (2010).

Abstract: स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

डीएनए डबल भूग्रस्त टूटता है सबसे खतरनाक डीएनए घावों कि आनुवंशिक जानकारी और कोशिका मृत्यु का भारी नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. Nonhomologous अंत (NHEJ) में शामिल होने और मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन): कोशिकाओं की मरम्मत दो प्रमुख रास्ते का उपयोग कर DSBs. NHEJ और मानव संसाधन के perturbations अक्सर समय से पहले बूढ़ा और tumorigenesis के साथ जुड़े रहे हैं, इसलिए यह महत्वपूर्ण है प्रत्येक DSB मरम्मत मार्ग को मापने का एक मात्रात्मक तरीका है. हमारी प्रयोगशाला फ्लोरोसेंट संवाददाता constructs कि NHEJ और मानव संसाधन के संवेदनशील और मात्रात्मक माप की अनुमति विकसित किया है. constructs एक इंजीनियर GFP एक दुर्लभ काटने DSBs के शामिल होने के लिए मैं SceI endonuclease के लिए मान्यता साइटों युक्त जीन पर आधारित हैं. शुरू constructs GFP नकारात्मक GFP जीन के रूप में एक अतिरिक्त एक्सॉन द्वारा निष्क्रिय है, या परिवर्तन के द्वारा. NHEJ या मानव संसाधन के द्वारा मैं SceI प्रेरित टूट की मरम्मत सफल कार्यात्मक GFP जीन restores. GFP सकारात्मक प्रवाह cytometry द्वारा गिना कोशिकाओं की संख्या NHEJ या मानव संसाधन दक्षता के मात्रात्मक उपाय प्रदान करता है.

Protocol: स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

इस प्रोटोकॉल में हम डीएनए DSB मरम्मत के विश्लेषण के लिए chromosomally एकीकृत संवाददाता के साथ विधि 1,2 जहां DSBs vivo में क्षणिक अभिव्यक्ति एक दुर्लभ काटने endonuclease 3 मैं SceI द्वारा प्रेरित कर रहे हैं constructs का वर्णन. एकीकृत परख DSB मरम्मत गुणसूत्र संदर्भ में विश्लेषण का लाभ प्रदान करता है. हालांकि, यह लंबे समय तक passaging सेल है, जो समस्याग्रस्त हो सकता है जब प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम कर सकते प्रोटोकॉल की आवश्यकता है.

एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक extrachromosomal परख जहां संवाददाता constructs मैं SceI या HindIII endonucleases के साथ इन विट्रो में पच जाता है और फिर रैखिक डीएनए के रूप में कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट है . exctrachromosomal परख प्रोटोकॉल 4 एकीकृत निम्नलिखित संशोधनों के साथ नीचे वर्णित परख करने के लिए इसी तरह की है. Extrachromosomal परख संवाददाता constructs के एकीकरण को छोड़ और बजाय सह NHEJ प्लाज्मिड संवाददाता मैं SceI या HindIII और अभिकर्मक नियंत्रण के रूप में pDsRed2-N1 के 0.1 μg के साथ इन विट्रो में linearized के 0.5 μg के साथ कोशिकाओं transfect. मानव संसाधन परख के लिए सह transfect 2 μg एचआर प्लाज्मिड संवाददाता मैं SceI या HindIII और 0.1 μg pDsRed2-N1 के साथ linearized. FACS अभिकर्मक के बाद तीन दिनों के द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण. extrachromosomal परख प्राथमिक आइसोलेट्स में DSB मरम्मत के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, व्यापक passaging सेल से परहेज है, और कई सेल लाइनों के विश्लेषण की सुविधा.

1. NHEJ और मानव संसाधन के लिए रिपोर्टर constructs

NHEJ रिपोर्टर 5 कैसेट एक इंजीनियर Pem1 जीन (GFP Pem1) से 3 केबी intron के साथ एक GFP जीन शामिल हैं . Pem1 intron एक adenoviral HindIII और मैं SceI endonucleases DSBs के शामिल होने के लिए (चित्रा 1 क) के लिए मान्यता अनुक्रम द्वारा flanked एक्सॉन शामिल हैं. मैं SceI साइटों उल्टे ओरिएंटेशन में हैं. मैं SceI एक nonpalindromic मान्यता अनुक्रम है, इसलिए दो उल्टे साइटों असंगत डीएनए समाप्त होता है (चित्रा -1 सी) उत्पन्न करते हैं. असंगत डीएनए समाप्त होता है सबसे अच्छा स्वाभाविक रूप से होने वाली DSBs नकल. बरकरार NHEJ कैसेट नकारात्मक GFP के रूप में adenoviral एक्सॉन GFP ओआरएफ बाधित है. मैं SceI द्वारा DSBs के शामिल होने पर, adenoviral एक्सॉन निकाल दिया है और NHEJ GFP जीन (चित्रा 2) के समारोह restores. इस NHEJ पत्रकार की अनूठी विशेषता यह है कि यह NHEJ घटनाओं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का पता लगाने के बाद intron विलोपन और सम्मिलन बर्दाश्त कर सकते हैं कर सकते हैं.

मानव संसाधन रिपोर्टर एक कैसेट (चित्रा 1b) भी GFP-Pem1 पर आधारित है. एचआर कैसेट में, GFP-Pem1 के पहले एक्सॉन 22 बीपी तीन प्रतिबंध साइटों, I-SceI/HindIII/I-SceI की प्रविष्टि के साथ संयुक्त विलोपन शामिल हैं. विलोपन सुनिश्चित करता है कि GFP एक NHEJ घटना से पुनर्गठन नहीं कर सकते हैं. दो साइटों मैं SceI उल्टे ओरिएंटेशन में हैं, ताकि मैं SceI पाचन असंगत समाप्त होता है (चित्रा -1 सी) पत्ते. GFP-Pem1 की पहली प्रति एक promoter-less/ATG-less पहली एक्सॉन और GFP-Pem1 के intron द्वारा पीछा किया जाता है. बरकरार GFP नकारात्मक का निर्माण है. एक DSB मैं SceI पाचन द्वारा शामिल होने पर कार्यात्मक GFP जीन intramolecular या intermolecular बीच पहली एक्सॉन GFP-Pem1 के दो प्रतियां उत्परिवर्तित जीन रूपांतरण द्वारा पुनर्गठित किया गया है. GFP जीन की दूसरी प्रतिलिपि के बाद से पहली ATG codon और दूसरा एक्सॉन की कमी है, पर पार या एकल भूग्रस्त annealing GFP गतिविधि बहाल नहीं करेंगे. इस जीन रूपांतरण की विशेष पहचान है, जो स्तनधारी कोशिकाओं में प्रमुख मानव संसाधन मार्ग (चित्रा 3) डिजाइन के लिए अनुमति देता है.

2. रिपोर्टर की एकता जीनोम में constructs

  1. NHEJ या मानव संसाधन संवाददाता प्लाज्मिड के एक उच्च गुणवत्ता की तैयारी करें. सर्वोत्तम परिणामों के लिए Qiagen Endo मुफ्त किट का उपयोग करें. Absorbance के द्वारा 260/280 एनएम प्लाज्मिड एकाग्रता और पवित्रता का उपाय.
  2. 50 μl में 50 NheI की 37 में 6 घंटे के लिए (प्रतिक्रिया की कुल मात्रा) यू के साथ पचाने प्लाज्मिड रिपोर्टर के 10 μg Linearize डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (करने के लिए, सूखी नहीं ब्लॉक करने के लिए वाष्पीकरण को रोकने के). Qiagen QiaexII किट, 10 मिमी Tris - एचसीएल पीएच 8.0 के 20 μl में elute डीएनए के साथ पाचन समाधान से डीएनए शुद्ध. उपाय डीएनए एकाग्रता और 260/280 एनएम शुद्धता absorbance के द्वारा. आमतौर पर, आप शुद्धि के दौरान डीएनए के 20-30% खो देंगे. उपज और एक जेल पर एक छोटे से विभाज्य (2 μl) चलाकर एक पचाया नहीं संवाददाता निर्माण के साथ साथ पाचन की पुष्टि करें. शुद्ध linearized संवाददाता का निर्माण 20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता
  3. अभिकर्मक के लिए तैयार करने में, सबसे अच्छा बढ़ रही हालत के लिए कोशिकाओं को लाने. यदि एक जमे हुए शीशी से शुरू, कोशिकाओं को विभाजित दो बार अभिकर्मक पहले. यदि मिला हुआ कोशिकाओं के एक थाली से शुरू, उन्हें एक बार विभाजित.
  4. 70-80% संगम (आमतौर पर दो दिन, सामान्य मानव fibroblasts के लिए अगर मढ़वाया 5x10 5 cells/100 मिमी प्लेट) के लिए कोशिकाओं के विकास. यह सबसे अच्छा अभिकर्मक दक्षता के लिए लघुगणकीय विकास में कोशिकाओं को लाने के लिए महत्वपूर्ण है. सक्रिय रूप से बढ़ संस्कृति एम चरण में कोशिकाओं (गोल सतह से जुड़ी कोशिकाओं के रूप में देखा) शामिल हैं.
  5. TransfAmaxa Nucleofector निम्नलिखित निर्माता की सिफारिशों का उपयोग कोशिकाओं ect. के लिए fibroblasts NHDF समाधान और U20 कार्यक्रम का उपयोग करें. अभिकर्मक के लिए, दो 100 मिमी प्लेट (~ 2x10 6 कोशिकाओं) से कोशिकाओं फसल . यह कक्षों पर नहीं trypsinize महत्वपूर्ण है. Trypsinization थाली से अलग कोशिकाओं के 80% के रूप में के रूप में जल्द बंद करो. NHDF समाधान में कोशिकाओं Resuspend. कक्ष NHDF समाधान के प्रति संवेदनशील हैं, इसलिए, ऊष्मायन समय कम से कम कोशिकाओं और धीरे मिश्रण. Linearized संवाददाता का निर्माण के 0.5 μg के साथ कोशिकाओं transfect. ये अभिकर्मक शर्तों, जब एक पत्रकार का एक भी कॉपी के एकीकरण में सामान्य मानव fibroblasts परिणाम के साथ इस्तेमाल किया integrants के बहुमत के लिए का निर्माण.
  6. अभिकर्मक के बाद 1 मिलीग्राम / एमएल (G418) geneticin 24 जोड़कर chromosomally एकीकृत संवाददाता constructs के साथ कोशिकाओं का चयन करें. 7-10 दिनों के लिए चयन जारी रखें.
  7. G418 प्रतिरोधी कालोनियों (आप व्यक्तिगत कालोनियों या प्रतिरोधी क्लोन पूल चुन सकते हैं) उठाओ. लगभग पांच 100 मिमी प्लेटों संस्कृति का विस्तार करें. भविष्य में उपयोग के लिए तीन प्लेटें रुक और वांछित सेल नंबर (आमतौर पर दस 100 मिमी प्लेटों पांच transfections के लिए पर्याप्त हैं) के लिए शेष दो प्लेटों का विस्तार.
  8. जब कोशिकाओं को 70-80% संगम (दो दिन 5 5x10 fibroblasts के लिए 100 मिमी प्लेट के प्रति कोशिकाओं चढ़ाना के बाद) तक पहुँचने, कोशिकाओं मैं - SceI व्यक्त प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट बनने के लिए तैयार हैं.

3. DSB की मैं SceI endonuclease के क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरण

  1. लघुगणकीय 5 μg मैं SceI एक अभिकर्मक दक्षता Amaxa Nucleofector (fibroblasts के लिए NHDF समाधान और U20 कार्यक्रम का उपयोग करें का उपयोग नियंत्रण के रूप में व्यक्त प्लाज्मिड और 0.1 μg pDsRed2-N1 (Clontech) का एक मिश्रण के साथ बढ़ती संस्कृति के transfect ~ 2x10 6 कोशिकाओं (दो प्लेटें) ).
  2. एक ही समय में () के साथ ~ 2x10 6 कोशिकाओं trasfecting द्वारा FACS के लिए तीन अंशांकन नियंत्रण तैयार 5 μg EGFP व्यक्त प्लाज्मिड, (ii) 5 μg pDsRed2-N1, (iii) एक नियंत्रण के 5 μg प्लाज्मिड कि एक व्यक्त नहीं करता है फ्लोरोसेंट प्रोटीन (हम एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग HPRT minigene का उपयोग कर रहे हैं).
  3. चार दिनों के लिए कोशिकाओं को विकसित करने GFP और DsRed प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त समय प्रदान करने के लिए.
  4. (वैकल्पिक) अभिकर्मक के बाद तीन दिन अभिकर्मक और GFP और DsRed का पता लगाने के लिए फिल्टर के साथ फ्लोरोसेंट उलटा माइक्रोस्कोप द्वारा GFP और DsRed प्रोटीन की अभिव्यक्ति की दक्षता को सत्यापित.

4. + GFP और DsRed + कोशिकाओं के प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण

  1. चार दिन अभिकर्मक मैं SceI फसल ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं और नियंत्रण की कोशिकाओं के बाद. पीबीएस के 500 μL में कोशिकाओं Resuspend और FACS ट्यूबों के लिए कोशिकाओं हस्तांतरण. इस स्तर पर यह सभी कोशिकाओं फसल और गोल आकार की कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, यह एक लंबी trypsinization समय या एक मजबूत trypsin का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. पुष्टि करें कि कोशिकाओं के 99% की थाली से अलग कर रहे हैं और खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं देख द्वारा गोल आकार है. प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर कोशिकाओं रखें (पन्नी के साथ बर्फ बाल्टी कवर). यह संभव है कुछ घंटों के लिए बर्फ पर कक्षों की दुकान है. सर्वोत्तम परिणामों के लिए फसल कटाई के बाद तुरंत कोशिकाओं का विश्लेषण.
  2. GFP, DsRed, और नकारात्मक नियंत्रण के साथ FACS जांचना. वोल्टेज और रंग मुआवजा समायोजित क्रम में करने के लिए विश्लेषण में सभी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं (चित्रा 4) शामिल है. ध्यान रखें कि प्रयोगात्मक नमूनों की फ्लोरोसेंट तीव्रता नियंत्रण की तुलना में कम हो जाएगा.
  3. विश्लेषण के लिए SceI - मैं FACS द्वारा कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट. हम प्रत्येक उपचार के लिए कम से कम 20,000 कक्षों की गिनती. GFP और DsRed प्रतिदीप्ति यह 25% से नीचे GFP का प्रतिशत + या DsRed + कोशिकाओं को रखने की सिफारिश की है. बीच संभावित हस्तक्षेप को रोकने के यदि DsRed + या GFP + कोशिकाओं का प्रतिशत अधिक है pDsRed2-N1 या मैं SceI प्लाज्मिड की राशि को कम. हमारे प्रयोगों में हम केवल pDsRed2-N1 की राशि प्लाज्मिड को समायोजित करने की जरूरत है, लेकिन मैं SceI प्लाज्मिड नहीं.
  4. GFP + कोशिकाओं के प्रतिशत के डीएनए DSB मरम्मत की दक्षता से मेल खाती है है और DsRed + कोशिकाओं के प्रतिशत अभिकर्मक की दक्षता को इंगित करता है. GFP + कोशिकाओं के DsRed + कोशिकाओं के अनुपात के रूप में डीएनए DSB मरम्मत के सापेक्ष दक्षता की गणना.
  5. मरम्मत अंत जंक्शनों मरम्मत की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए अनुक्रम हो सकता है. रिपोर्टर constructs ई. कोलाई प्रतिकृति का मूल और kanamycin प्रतिरोध जीनों (चित्रा 1) होते हैं. यह EcoRI एंजाइम, recircularization, और सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं में परिवर्तन के साथ जीनोमिक डीएनए पचाने के द्वारा constructs बचाव सक्षम बनाता है. बचाया plasmids तो प्रतिबंध पाचन और अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम

नियंत्रण transfections की और NHEJ और मानव संसाधन प्रयोगों के विशिष्ट FACS परिणाम 4 और 5 आंकड़े में दिखाया जाता है. मैं SceI ट्रांसफ़ेक्ट integrat युक्त कोशिकाओं में प्रतिदीप्त तीव्रता और फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या कम हो जाएगाएड NHEJ और मानव संसाधन constructs (चित्रा 5) (चित्रा 4) नियंत्रण GFP और इन कोशिकाओं में DsRed constructs की नकल संख्या में अंतर के कारण की तुलना में. एकीकृत संवाददाता निर्माण के प्रयोग में प्रत्येक कक्ष का केवल एक प्रतिलिपि होती है, इस प्रकार सफल मरम्मत घटनाओं reconstitute कोशिकाओं के एक अंश में GFP जीन. मानव fibroblasts में 0.1 μg pDsRed2-N1 के साथ अभिकर्मक लगभग 1 सेल प्रति प्लाज्मिड की नकल बचाता है.

NHEJ और मानव संसाधन की दक्षता GFP + / DsRed + कोशिकाओं के अनुपात के रूप में गणना की है. NHEJ मानव कोशिकाओं में 2 मानव संसाधन की तुलना में अधिक कुशल प्रक्रिया है. मानव fibroblasts में NHEJ दक्षता आम तौर पर 0.6-1.3, और मानव संसाधन दक्षता 0.05-0.3 है. चूंकि DSB दक्षता अनुपात GFP के रूप में मापा जाता है / DsRed + मैं SceI और DsRed2-N1 plasmids के मिश्रण में कोशिकाओं विविधताओं परिणाम को प्रभावित कर सकता है. प्लाज्मिड गुणवत्ता अभिकर्मक दक्षता बदलकर भी परिणाम को प्रभावित कर सकता है. इसलिए, अनुरूप माप प्राप्त करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है के एक प्रयोग के भीतर ही प्लाज्मिड मिश्रण का उपयोग. इसके अलावा, DSB मरम्मत दक्षता सेल प्रकार, कोशिका चक्र चरण, और एकीकृत constructs के गुणसूत्र स्थान से प्रभावित है.

चित्रा 1
चित्रा 1. रिपोर्टर NHEJ (ए) और मानव संसाधन (बी) के द्वारा डीएनए DSB मरम्मत के विश्लेषण के लिए constructs . (सी) असंगत डीएनए दो उल्टे मैं SceI साइटों के पाचन से उत्पन्न समाप्त होता है एसडी, ब्याह दाता, एसए, ब्याह स्वीकर्ता; छायांकित वर्गों, polyadenylation साइटों, नव / काना, एकल ओआरएफ दो प्रमोटरों द्वारा नियंत्रित: SV40 प्रदान neomycin में प्रतिरोध स्तनधारी कोशिकाओं, और β-lactamase प्रदान ई. कोलाई में kanamicyn प्रतिरोध, मूल, ई. कोलि प्रतिकृति का PUC मूल.

चित्रा 2
चित्रा 2. रिपोर्टर NHEJ के विश्लेषण के लिए निर्माण इस में निर्माण GFP जीन निष्क्रिय है, लेकिन एक DSB और सफल NHEJ की प्रेरण पर का निर्माण + GFP हो जाता है. नीचे दिखाया गया है इस संवाददाता के एक NHEJ द्वारा मरम्मत उत्पाद है.

चित्रा 3
चित्रा 3. रिपोर्टर जीन रूपांतरण द्वारा मानव संसाधन के विश्लेषण के लिए निर्माण DSBs की मैं SceI, मानव संसाधन द्वारा जीन रूपांतरण (जीसी) द्वारा शामिल होने पर एक सक्रिय GFP जीन reconstitutes.. जीसी, पार से अधिक (X ओवर), एकल भूग्रस्त annealing (एसएसए), और NHEJ: नीचे दिखाया गया है इस संवाददाता के प्रमुख डीएनए की मरम्मत रास्ते द्वारा मरम्मत उत्पादों रहे हैं. एक्स से अधिक - मरम्मत उत्पाद intramolecular पुनर्संयोजन के लिए दिखाया गया है, exramolecular पुनर्संयोजन एक ही उत्पाद दे, लेकिन एक गुणसूत्र पर स्थित है. सक्रिय GFP प्रोटीन व्यक्त जीन (GFP +) हरे रंग से दर्शाया है.

चित्रा 4
चित्रा 4. (ए) FACS विश्लेषण के लिए मानकों के अंशांकन Fibroblasts प्लाज्मिड pHPRT साथ ट्रांसफ़ेक्ट, ऑटो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को छोड़कर के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया. (बी) Fibroblasts प्लाज्मिड pEGFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट GFP + कोशिकाओं (हरित क्षेत्र) के लिए gating स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया. (सी) Fibroblasts प्लाज्मिड pDsRed2 n1, DsRed + कोशिकाओं (लाल क्षेत्र) के लिए gating सेटिंग के लिए इस्तेमाल के साथ ट्रांसफ़ेक्ट.

चित्रा 5
चित्रा 5. Chromosomally एकीकृत संवाददाता constructs के साथ सामान्य मानव fibroblasts में NHEJ (ए) और मानव संसाधन (बी) के विश्लेषण के विशिष्ट परिणाम है .

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Discussion: स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

फ्लोरोसेंट NHEJ और मानव संसाधन संवाददाता assays vivo में अलग से प्रत्येक DSB मरम्मत मार्ग को मापने के लिए एक मात्रात्मक तरीके प्रदान करते हैं . assays के बहुत संवेदनशील होते हैं, के रूप में FACS मज़बूती से 20,000 कोशिकाओं में 10 GFP + कोशिकाओं का पता लगा सकते हैं. assays मिनट या घंटे के भीतर दो DSBs के अधिष्ठापन के बाद GFP + कोशिकाओं की उपस्थिति का पता लगाने के द्वारा "वास्तविक समय" में मरम्मत की घटनाओं को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अलावा, GFP + कोशिकाओं का विश्लेषण अतिरिक्त सेल प्रसार पर भरोसा नहीं करता अनुमति DSB मरम्मत कि 6 गिरफ्तारी कोशिका विभाजन विभिन्न दवाओं के साथ इलाज के बाद अलग सेल चक्र के चरणों में विश्लेषण. यह संवाददाता एक चयन मार्कर के पुनर्गठन पर आधारित constructs पर एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है.

NHEJ प्रक्रिया आंतरिक रूप से त्रुटि - प्रवण पैदा समाप्त होता है जंक्शनों पर विभिन्न छोटे rearrangements. हमारे NHEJ पत्रकार की अद्वितीय संपत्ति है कि मरम्मत की घटनाओं एक intron, जो विलोपन और सम्मिलन बर्दाश्त के भीतर होते हैं, इस प्रकार NHEJ घटनाओं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का पता लगाने की अनुमति है. मानव संसाधन का निर्माण एक ही संशोधित GFP जीन पर आधारित है के रूप में NHEJ NHEJ और मानव संसाधन का तुलनात्मक विश्लेषण की अनुमति निर्माण. फ्लोरोसेंट NHEJ और मानव संसाधन assays का उपयोग स्तनधारी DSB मरम्मत के अध्ययन की सुविधा होगी.

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Disclosures: स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements: स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

मूल GFP-Pem1 डॉ. Lei ली से एक उपहार था. यह काम NIH और एलिसन मेडिकल फाउंडेशन से VG अनुदान द्वारा और के रूप में समर्थित किया गया था

Materials: स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

Name Company Catalog Number Comments
EndoFree Plasmid Maxi kit Qiagen 12362
Qiaex II Gel Extraction Kit Qiagen 20021
Amaxa Nucleofector Lonza Inc. AAD-1001
Geneticin (G418) Invitrogen 11811-031
pDsRed2-N1 Clontech Laboratories 632406
Round bottom tubes BD Biosciences 352058 FACS tubes

References: स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

  1. Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y. & Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 13068-73 (2007).
  2. Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A. & Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst) 7, 1765-71 (2008).
  3. Rouet, P., Smih, F. & Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 6064-8 (1994).
  4. Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A. & Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia 11, 683-91 (2009).
  5. Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O.M., Wilson, J.H. & Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 7624-9 (2004).
  6. Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A. & Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle 7, 2902-6 (2008).

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