Analys av DNA dubbel-strängen Break (DSB) Reparation i däggdjursceller

I detta protokoll beskriver vi den metod för analys av DNA DSB reparation med kromosomalt integrerad reporter konstruerar ^1,2 där DSBs induceras in vivo av övergående uttryck en sällsynt skär endonuclease I-SCEI ^3. Den integrerade analysen ger fördelen av att analysera DSB reparation inom kromosomala sammanhang. Detta kräver dock protokoll långvarig cell passaging, vilket kan vara problematiskt när man arbetar med primära celler.

Ett alternativ är en extrakromosomala analys där reportern konstruktioner smälts in vitro med I-SCEI eller HindIII endonukleaser och sedan transfekterade in i cellerna som linjär DNA. Den exctrachromosomal analysen protokoll ⁴ liknar den integrerade analysen beskrivs nedan med följande ändringar. För extrakromosomala analysen utelämna en integrering av reportern konstruktioner och istället samarbeta transfektera cellerna med 0,5 mikrogram NHEJ reporter plasmiden linjäriserade in vitro med I-SCEI eller HindIII och 0,1 mikrogram pDsRed2-N1 transfektion kontroll. För HR-analysen samarbete transfektera 2 mikrogram HR-reporter plasmid linjäriserade med I-SCEI eller HindIII och 0,1 mikrogram pDsRed2-N1. Analysera cellerna genom FACS tre dagar efter transfektion. Den extrakromosomala analysen möjliggör analys av DSB reparation i primära isolat, undvika omfattande cell passaging, och underlätta analysen av flera cellinjer.

1. Reporter Konstruerar för NHEJ och HR

Den NHEJ reporter kassett ⁵ innehåller en GFP-genen med en konstruerad 3 kb intron från den Pem1 genen (GFP-Pem1). Den Pem1 intron innehåller en adenovirala exon flankeras av erkännande sekvenser för HindIII och I-SCEI endonukleaser (Figur 1a) för induktion av DSBs. I-SCEI platser är inverterad orientering. I-SCEI har en nonpalindromic erkännande sekvens, därav två inverterade webbplatser genererar oförenliga DNA ändar (figur 1c). Inkompatibla DNA slutar bästa efterlikna naturligt förekommande DSBs. Den intakta NHEJ Kassetten är GFP negativt som adenovirala exon stör GFP ORF. Vid induktion av DSBs av I-SCEI är adenovirala exon bort och NHEJ återställer funktion av GFP-genen (Figur 2). Det unika med denna NHEJ reporter är att man kan upptäcka ett brett spektrum av NHEJ händelser sedan den intron kan tolerera borttagningar och infogningar.

HR reporter kassett ¹ (Figur 1b) är också baserad på GFP-Pem1. Inom HR-kassett, innehåller den första exon av GFP-Pem1 en 22 bp radering i kombination med införandet av tre begränsning webbplatser, I-SceI/HindIII/I-SceI. Strykningen gör att GFP inte kan beredas genom en NHEJ händelse. De två I-SCEI platser är i inverterad läggning, så att jag-SCEI matsmältningen lämnar oförenliga ändar (figur 1c). Den första kopian av GFP-Pem1 följs av en promoter-less/ATG-less first exon och intron av GFP-Pem1. Den intakta konstruktion är GFP-negativ. Vid induktion av en DSB av I-SCEI matsmältningen den funktionella GFP-genen bereds genom intramolekylära eller intermolekylära genkonversion mellan de muterade två kopior av den första GFP-Pem1 exon. Eftersom den andra kopian av GFP-genen saknas den första ATG kodon och den andra exon, korsar över eller enkelsträngbrott glödgning återställer inte GFP aktivitet. Denna konstruktion gör att den exklusiva detektion av gen konvertering, som är den dominerande HR-väg i däggdjursceller (Figur 3).

2. Integrering av Reporter Konstruerar i genomet

1. Gör en hög kvalitet beredning av NHEJ eller HR reporter plasmid. För bästa resultat använd Qiagen Endo Free Kit. Mät plasmid koncentration och renhet av absorbans vid 260/280 nm.
2. Linjärisera 10 mikrogram av reportern plasmiden genom uppslutning med 50 U NheI i 50 l (total volym av reaktionen) i 6 timmar i 37 ° C inkubator (använd inte den torra blocket, för att förhindra avdunstning). Rena DNA från matsmältningen lösning med Qiagen QiaexII Kit, eluera DNA i 20 ìl av 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Mät DNA-koncentration och renhet av absorbans vid 260/280 nm. Vanligtvis kommer du att förlora 20-30% av DNA under reningen. Bekräfta avkastning och matsmältningen genom att köra ett litet delprov (2 l) på en gel, tillsammans med en osmält reporter konstruktion. Det renade linjäriserade reporter konstruera kan förvaras vid 20 ° C.
3. Som förberedelse för transfektion, föra celler till det bästa växande skick. Om början från en frusen flaska, dela upp cellerna två gånger innan transfektion. Om utgår från en tallrik sammanhängande celler, dela upp dem en gång.
4. Odla cellerna att 70-80% sammanflödet (vanligtvis två dagar, om pläterade 5x10 ⁵ cells/100 mm plåt, för normala mänskliga fibroblaster). Det är viktigt för bästa transfektion effektivitet för att få celler i logaritmisk tillväxt. Aktivt växande kulturen innehåller celler i M stadium (syns som rundade celler fastnat på ytan).
5. Överfect cellerna med hjälp av Amaxa Nucleofector efter tillverkarens rekommendationer. För fibroblaster använda NHDF lösning och program för U20. För transfektion, skörda celler från två 100 mm plattor (~ 2x10 ⁶ celler). Det är viktigt att inte över trypsinize cellerna. Sluta trypsinization så snart som 80% av cellerna lossnat från plattan. Resuspendera cellerna i NHDF lösning. Celler är känsliga för NHDF lösning, därför minimera inkubationstiden och blanda cellerna försiktigt. Transfektera cellerna med 0,5 mikrogram av linjär reporter konstruktion. Dessa transfektion villkor, när de används med vanliga mänskliga fibroblaster resultera i integrationen av en enda kopia av en reporter bygga för majoriteten av integrants.
6. Markera cellerna med kromosomalt integrerad reporter konstruktioner genom att lägga till 1 mg / ml geneticin (G418) 24h efter transfektion. Fortsätt val i 7-10 dagar.
7. Plocka G418 resistenta kolonier (du kan plocka enskilda kolonier eller poolen de resistenta kloner). Expandera kultur till cirka fem 100 mm plattor. Frys tre plattor för framtida bruk och expandera återstående två plattor till önskad cell nummer (vanligtvis tio 100 mm plattor räcker för fem transfections).
8. När cellerna når 70-80% sammanflödet (två dagar efter bordläggning 5x10 ⁵ celler per 100 mm plåt för fibroblaster), cellerna är redo att transfekterade med I-SCEI uttrycka plasmid.

3. Induktion av DSB av Transient Redovisning av I-SCEI Endonuclease

1. Transfektera ~ 2x10 ⁶ celler (två plattor) av logaritmiskt växande kultur med en blandning av 5 mikrogram I-SCEI uttrycka plasmid och 0,1 mikrogram pDsRed2-N1 (Clontech) som en transfektion effektivitet kontroll med Amaxa Nucleofector (använd NHDF lösning och U20 program för fibroblaster ).
2. Samtidigt förbereder tre kalibrering kontroller för FACS av trasfecting ~ 2x10 ⁶ celler med (i) 5 mikrogram EGFP-uttryckande plasmid, (ii) 5 mikrogram pDsRed2-N1, (iii) 5 mikrogram för en kontroll plasmid som inte uttrycker en fluorescerande protein (vi använder en plasmid kodning HPRT minigene).
3. Odla cellerna i fyra dagar för att ge tillräcklig tid för uttryck av GFP och DsRed proteiner.
4. (Valfritt) Tre dagar efter transfektion kontrollera effektiviteten i transfektion och uttryck av GFP och DsRed proteiner av fluorescerande inverterat mikroskop med filter för detektering av GFP och DsRed.

4. Analys av GFP + och DsRed Cells + med flödescytometri

1. Fyra dagar efter transfektion skörden transfekterade I-SCEI cellerna och kontroll. Resuspendera cellerna i 500 mikroliter av PBS och överföra celler till FACS rören. I detta skede är det viktigt att skörda alla celler och har celler i rund form. För att uppnå detta är det rekommenderat att använda en längre trypsinization tid eller en starkare trypsin. Kontrollera att 99% av cellerna loss från plattan och har runda formen genom att observera celler under mikroskop. Håll cellerna på is skyddas från ljus (täcka ishink med folie). Det är möjligt att lagra cellerna på is under några timmar. För bästa resultat analyserar celler direkt efter skörd.
2. Kalibrera FACS med GFP, DsRed och de negativa kontrollerna. Justera spänning och färg ersättning i syfte att inkludera alla fluorescerande celler i analysen (Figur 4). Tänk på att den fluorescerande intensiteten i experimentella prover kommer att vara lägre än för kontrollerna.
3. Analysera I-SCEI transfekterade celler genom FACS. Vi räknar med minst 20.000 celler för varje behandling. För att förhindra risken för störningar mellan GFP och DsRed fluorescens det rekommenderas att hålla procent av GFP + eller DsRed + celler under 25%. Om andelen DsRed + eller GFP + celler är högre minska mängden pDsRed2-N1 eller I-SCEI plasmid. I våra experiment har vi behövde bara justera mängden pDsRed2-N1 plasmid, men inte I-SCEI plasmid.
4. I procent av GFP + celler motsvarar effektiviteten av DNA DSB reparation och procent av DsRed + celler indikerar effektivitet transfektion. Beräkna den relativa effektiviteten av DNA DSB reparation som kvoten av GFP + celler till DsRed + celler.
5. Den reparerade slutet korsningar kan sekvenseras för att testa riktigheten av reparation. Reportern konstruerar innehålla E.coli ursprung replikering och kanamycin resistensgener (Figur 1). Detta gör det möjligt att rädda konstruktioner genom uppslutning av arvsmassans DNA med EcoRI enzym, recircularization och omvandling till behöriga E. coli celler. De räddade plasmider analyseras sedan av begränsning matsmältning och sekvensering.

5. Representativa resultat

Typiska FACS resultatet av kontrollen transfections och NHEJ och HR experiment visas i figur 4 och 5. Lysrör intensitet och antalet fluorescerande celler kommer att vara lägre i I-SCEI transfekterade cellerna med integreratED NHEJ och HR konstruktioner (Figur 5) jämfört med kontroller (Figur 4) på ​​grund av skillnaden i antal kopior av GFP och DsRed konstruktioner i dessa celler. Varje cell i experimentet innehåller endast en kopia av den integrerade reportern konstruera, vilket lyckad reparation händelser kommer rekonstruera GFP-genen i en bråkdel av cellerna. Transfektion med 0,1 mikrogram pDsRed2-N1 i mänskliga fibroblaster levererar cirka 1 plasmid exemplar per cell.

Effektiviteten i NHEJ och HR beräknas som en andel av GFP + / DsRed + celler. NHEJ är en effektivare process än HR i mänskliga celler ^2. I humana fibroblaster i NHEJ effektivitet är vanligtvis 0,6-1,3 och HR-effektivitet är 0,05-0,3. Sedan DSB effektivitet mäts som förhållandet GFP + / DsRed + celler variationer i en blandning av I-SCEI och DsRed2-N1 plasmider kan påverka resultatet. Den plasmid kvalitet kan också påverka resultaten genom att ändra transfektion effektivitet. Därför att få konsekventa mätningar är det viktigt att använda samma plasmiden mix inom en experiment. Dessutom är DSB reparation effektivitet påverkas av celltyp, cellcykeln fas och kromosomala läge integrerade konstruktioner.

Figur 1. Reporter konstruktioner för analys av DNA DSB reparation av NHEJ (A) och HR (B). (C) Inkompatibla DNA slutar genereras genom rötning av två inverterade I-SCEI webbplatser SD, skarva givaren, SA, skarva acceptor, skuggiga torg, polyadenylation platser, Neo / Kana, enkel ORF kontrolleras av två projektansvariga:. SV40 ger neomycin motstånd i däggdjur celler, och β-laktamas ger kanamicyn motstånd i E. coli, Ori, E. Coli pUC ursprung replikering.

Figur 2. Reporter konstruera för analys av NHEJ I denna konstruktion GFP-genen är inaktiv;. Men vid induktion av en DSB och framgångsrik NHEJ konstruktionen blir GFP +. Nedan är en reparation produkt av detta reporter med NHEJ.

Figur 3. Reporter konstruera för analys av HR av gen konvertering. Vid induktion av DSBs av I-SCEI, HR genom genkonversion (GC) återuppstår en aktiv GFP-genen. Nedan visas reparation produkter av denna reporter som de stora vägar DNA-reparation: GC, överkorsning (X-over), sträng glödgning (SSA) och NHEJ. X-over reparera produkten visas för intramolekylära rekombination kommer exramolecular rekombination ge samma produkt, men ligger på en kromosom. Gener som är aktiva GFP protein (GFP +) indikeras med grön färg.

Figur 4. Kalibrering av parametrar för FACS-analys. (A) fibroblasts transfererats med pHPRT plasmiden, används som negativ kontroll för att utesluta auto fluorescerande celler. (B) fibroblasts transfererats med pEGFP plasmider, används för att ställa i gaten för GFP + celler (gröna området). (C) fibroblasts transfererats med pDsRed2-N1 plasmid, som används för att ställa i gaten för DsRed + celler (rött område).

Figur 5. Typiska resultat av analysen av NHEJ (A) och HR (B) i normala mänskliga fibroblaster med kromosomalt integrerad reporter konstruktioner.

Den fluorescerande NHEJ och HR-analyser reporter ge ett kvantitativt sätt för separat mätning av varje DSB reparation väg in vivo. De analyser är mycket känsliga, eftersom FACS tillförlitligt kan detektera 10 celler GFP + i 20.000 celler. Analyserna kan anpassas för att mäta reparation händelser i "realtid" genom att upptäcka förekomsten av GFP + celler inom minuter eller timmar efter induktion av DSBs ^2. Dessutom har åberopat en analys av GFP + celler inte om ytterligare celldelning, vilket gör att DSB reparation kan analyseras på olika stadier cellcykeln efter behandling med olika läkemedel som gripandet celldelning ^6. Detta ger en viktig fördel jämfört reporter konstruktioner baserade på ombildning av en markör.

Den NHEJ processen är i sig felbenägen generera olika små omdisponeringar i ändarna korsningar. Den unika egenskapen vår NHEJ reporter är att reparera händelser inträffar inom en intron, som tål strykningar och tillägg, vilket möjliggör detektion av ett brett spektrum av NHEJ händelser. HR bygga bygger på den modifierade samma GFP-genen som NHEJ konstruera låta jämförande analys av NHEJ och HR. Användningen av fluorescerande NHEJ och HR-analyser kommer att underlätta studier av däggdjur DSB reparation.