Patterned Photostimulation עם התקנים דיגיטליים Micromirror לחקור שילוב דנדריטים מעבר סניף נקודות

עיצוב שיקולים כללי

אם אורך הגל של גירוי תמונה נמצאת בטווח הנראה לעין, כגון ניסויים optogenetic, את הפריסה של המערכת יהיה הרבה יותר פשוט עבור ניסויים photolysis UV. צריך רק לרכוש מצלמה כפול יציאת מודול זמין מכל החברות מיקרוסקופ. המטוס DMD יכול להיות מוצב במרחק של המטוס תמונה המצומד של אחד אחד משני הנמלים המצלמה. אבל photolysis UV באור שמקורו DMD חייב להיות מובא דרך נתיב עלית תאורה (איור 3A), כי הצינור המוביל הדמיה העדשה המצלמה לא תוקנה על הגל UV בכל אחד מיקרוסקופים זמינים מסחרית. סטייה כדורית של העדשה צינור הדמיה ב 350 ננומטר הוא חמור מספיק כדי למנוע את היכולת למקד את האור לנקודה חזק כדי לייצר ברזולוציה מרחבית מספקת. בעיה זו לא נתקל מיקרוסקופיה confocal כי העדשה צינור מוסר כאשר קרן לייזר collimated הוא הביא לאורך ציר אופטי זהה. הבעיה של תאורה UV יכולה להיפתר על ידי להביא את האור דרך נתיב עלית פלורסנט כי העדשות צינור יש לתקן את כל חלקי סטייה כדורית באורך גל UV. אנחנו יכולים להרחיב על אופטיקה של מיקרוסקופים במידה כלשהי מבקשת העת. הקהילה המדעית היא עניין מהיר כללית בנושא זה ואין מקורות רבים אשר מלמדת את זה היטב.

כדי למזער שינויים של המיקרוסקופ וגם בגלל אילוצי מקום הדוקה ביחידת עלית הקרינה, DMD ממוקם על המטוס החדש שנוצר תמונת המצומד שנוצר על ידי העדשה ממסר (להצביע על המיקום של יחידת DMD ביחס המיקרוסקופ). UV מסחרי לתקן עדשה ממסר נרכש (אופטיקה מיוחדים) (לציין זאת בתרשים על המיקרוסקופ).

תאורה של DMD

עם קבלת קלט בינארי שלה micromirror יכול לעבור בין חיובי שלילי 12 ° הטיה ביחס למישור של השבב. ציר הסיבוב הוא לאורך הפינות של כל מראה אלכסוני (45 ° עד צידי השבב). הכיוון של הסיבוב מראה מיועד ידי משולש בצבע זהב בפינה אחת על המשטח הקדמי של השבב. זווית הטיה של micromirror מכתיב את היישור של המגרש azithmus של קרן אור הנכנסת. ההגשה של הקורה תאורה צריך להיות ° 24 מ בניצב לציר של השבב DMD והצרכים azithmus להיות בניצב לציר הסיבוב של המראה. יישור קרן מדויקת היא קריטית לתפעול יעיל. במערכת אבטיפוס עיצבנו מספר התאמות להטות ידנית שאיפשרה לנו לתקן הליקויים בתכנון מכונות. זה הביא למערכת כי הוא הרבה יותר מגושמים הוא הכרחי. הסדר חלופי, קומפקטית יותר להבאת לאור אפשרי (הצג עיצוב חלופי אם יראו שימושי).

על הניסויים photolysis מקור לייזר נדרש כדי ליצור את עוצמת אור גבוהה קרן ממוקדת הכרחי משחררות רפרוף מהיר. על הניסויים optogenetic שם אור בעוצמה גבוהה ממוקד בחדות אינו נדרש, מקור אור לא קוהרנטי יהיה הולם. במהלך הניסוי המתואר כאן photolysis העסקנו דיודה מעין רציף שאוב מצב מוצק (DPSS) תדירות שילש NdVO4 לייזר (1 ואט, 355 ננומטר). (לדיון מפורט של הבחירות של מקורות אור עבור photolysis לראות התייחסות 2). לייזר בהספק גבוה יחסית נדרש הניסויים שתוארו כאן, כי רק חלק קטן של פלט הלייזר מועברת בפועל הדגימה בעת שימוש במערכת DMD. כמות האור נמסר הדגימה הוא יחסי היחס של מספר ON / OFF מראות בתוך האזור מואר על ידי קרן לייזר.

אם מקור אור לייזר נדרש, מוטב להשיק את הפלט של הלייזר לתוך סיב multimode כך ניתן בקלות המיקום לאורך הציר בכיוון הנכון עבור הארת DMD. העברת אור דרך סיב אופטי פותר הבעיה השנייה, איך לחסל את דפוסי רבב הטבועה תאורה קוהרנטית. סיבים הוא נכרך סביב אלונקה סיבים פיזואלקטריים (דגם 915, מכשור המחקר הקנדי & בע"מ) אשר נעה ב ~ 40 kHz. (נקודה אלה החוצה המתקן) מיקרוסקופיים מתיחה של סיבים די מעביר את דפוס רבב פעמים רבות במהלך משך אלפיות השנייה של הדופק בכל גירוי צילום, ובכך למעשה לבטל את ההשפעה של ככתמים. הפלט של סיב אופטי הוא collimated אז במטרה במיקרוסקופ UV (אולימפוס DApo20UV). (בשלב זה החוצה) כיול ההחלטה אופטי של המערכת מוצג באיור. 3B. ההחלטה פיזיולוגי יעיל, כפי שהיא נמדדת כפונקציה של המיקום של המקום של צילום משרעת של זרימת הזרםגירוי מוצג באיור. 3C. תגובות הנוכחית כדי photostimulation בעוצמות שונות מומחשים איור. 3D.

מבצע של המערכת:

Co-רישום CCD פיקסלים עם המראות DMD

התוכנה in-house נכתב הקובע את ההתכתבות של מראות DMD הפרט פיקסלים ספציפיים של המצלמה הדמיה CCD. ממשק המשתמש הגרפי (GUI) בתוך מערכת זו מאפשרת למשתמש הקצה את מראות DMD התואם לאזור על התמונה CCD מתויג על ידי העכבר. לכן, המיקום לגירוי תמונה יכול להיות מתויג פשוט על ידי הזזת הסמן מעל התמונה המוצגת על מסך המחשב ולחיצה על אזור מתויג של עניין. (תמונה הניאון של סוכת הדנדריטים יוצג על מסך המחשב. הסטודנט יציין מספר מקומות מעל התמונה על מסך המחשב).

תכנות דפוסי למסירה אור

דפוס מסומן על מסך המחשב על ידי המפעיל מאוחסן כסדרה של תמונות נפרדות. העיתוי של פעימות לייזר לכל דפוס מרחבי מתוכנת מכן לתוך התוכנה אשר משולבת עם תוכנית רכישת נתונים (pClamp). (להוכיח זאת).

תיאום פעימות לייזר לדפוסי DMD

תוכנית הרכישה נתונים יוזם ומתאם את התזמון של האלקטרוניקה DMD, gating של הלייזר, ורכישת התיקון הידק האות החשמלי של הנוירון היעד. (לדמות זה רצף במחשב)

ניסויית נתונים:

שאינו ליניארי סיכום ברחבי דיסטלי נקודות סניף הדנדריטים

שילוב דנדריטים עם אלקטרודות באופן מסורתי בוצעו על ידי שינוי משרעת של גירוי במקומות נפרדים ולא להרחיב את אזור הגירוי תוך שמירה על עוצמת מתמדת. סוגיות הנוגעות הרוויה של electrogenesis וגיוס ערוצי תלוי במיקום יכולים להשפיע על התוצאה והמסקנה. גירוי הדנדריטים מבוזר יכול להיות מיושם בקלות באמצעות מערכת המבוססת DMD (איור 4 א). עוצמת קלט היתה מגוונת על ידי הגדלת מספר נקודות של photostimulation. אנו יכולים לראות כי סיכום מרחבי יכול להיות שאינו ליניארי על פני נקודות הסניף הופך יותר ויותר לעיל ליניארי עם אמפליטודות קלט הגדלת המגיעים על שני סניפים בת. העל ליניאריות מתווכת בעיקר רצפטורים NMDA ולא מתח ערוצי מגודרת (איור 5)

נציג תוצאות

באיור 1. מבצע של micromirrors ב DMD. (מבט צד) כוחות אלקטרוסטטיים מכוונים מראות הפרט לגרום המראה להיות מוטה באחד משני כיוונים אפשריים 12 ° מן האופקי. במצב ON קרן תקרית מופנית בניצב לאורך הציר האופטי של השבב. במצב OFF הקורה האירוע מכוון ציר 48 ° משם. אור שפוגע הפערים דק בין המראות מופנית ° 24 מעל ציר. (תצוגה למעלה) הטיה מכוונת 45 ° ביחס צידי מראות שבב.

איור 2. הפריסה יסוד של מיקרוסקופ פלואורסצנטי המודרנית. קוביה המסנן ממוקם בתוך "מרחב האינסוף" בין המטרה לבין העדשה צינור. יש שביל שמוביל הדמיה המצלמה ויש נתיב ההארה שמביא את האור המדגם. העדשה צינור עבור נתיב אור שני אלה הם בדרך כלל שונים בעיצוב של אורך המוקד. תאורה, אבל לא הדמיה, עדשה הצינור מיועד המבצע בספקטרום UV.

איור 3. פריסה של מערכת UV DMD מבוסס. אם התאורה היא בספקטרום UV, אז זה חייב להיות מובא מבעד לעדשה הצינור הוא תיקן עבור UV. העדשה צינור בנתיב הדמיה אינו מיועד UV. מערכת ממסר יש צורך ליצור דימוי נגיש מטוס המצומד. תמונה שונה המצומד מטוסים המיקרוסקופ מסומן על ידי קווים אדומים מנוקדים. דפוסי מוארת במישור תמונה אחת מוקרנים במטוסים המצומד אחרים. במהלך הדמיה דפוס במטוס מדגם מוקרנת על הגלאי / מצלמה. עבור תאורה דפוס שנוצר על ידי DMD היא מוקרנת על המדגם.

איור 4. פריסת מערכת הקרנת האור הנראה DMD. אם נורית תאורה נמצאת בטווח הנראה לעין, אפשר להביא את התבנית DMD האור שנוצר דרך נתיב האור הדמיה. זה יכול להיות מיושם בקלות עם commerciאל נמל כפול המצלמה קבצים מצורפים dichroic את המראה המתאים.

איור 5. ברזולוציה רוחבית של המערכת. (א) רזולוציה אופטית על המטרה ניאון הוא ~ 2 מיקרומטר. (ב) החלטה אפקטיבית, כפי שהיא נמדדת על פני דנדריט ידי photolysis של גלוטמט בכלוב היא ~ 5 מיקרומטר. המרחק גדל נובע משילוב של דיפוזיה של גלוטמט ורוחב סופי של דנדריט. (ג) Photolysis יכול לחקות את קינטיקה של אירועים הסינפטי. משפחתו של מתח הידק התגובות הנוכחי נובע וריאציות אנרגיית האור נמסר דנדריט.

איור 6. שאינו ליניארי סיכום נקודות על פני סניף הדנדריטים. (א) תשומות מבוזרת מוחלים על שני סניפים הדנדריטים בנפרד. התגובות שלהם מתח מוצגים להלן. (ב) גירויים ניתנים ואז בו זמנית. התגובה נמדד (אדום זכר) הוא שונה מסכום החשבון של שתי התגובות הפרט (אפור זכר).

איור 7. סיכום Supralinear הקולטן NMDA הוא תלוי. (א) APV, אנטגוניסט לרצפטור NMDA סלקטיבית חוסם את סיכום supralinear. (ב) עוצמת הגירוי היחסים ואת הרגישות שלו אנטגוניסט לרצפטור NMDA הוא זממו.

היתרון של גישה DMD photostimulation מבוסס ניכר ביותר במצבים שבהם המטרה תופסת שטח גדול יחסית. אם המטרה של עניין הוא קטן מאוד, כגון הקוצים הדנדריטים כמה מערכות סריקה סדרתית confocal ו -2 פוטון צפויים להיות גישה טובה יותר. אחת חולשה משמעותית של הגישה DMD היא שימוש לא יעיל של האור זמין. עיקר האור זמין מכוונת בהכרח את המראות OFF ולא בשימוש.

המערכת מבוססת DMD המתאימה ביותר בטווח הנראה לניתוח. אנו צופים DMD מערכות photostimulation מבוסס יגרום השפעה משמעותית כאשר עובדים עם ניסויים optogenetics.