ड्रोसोफिला भ्रूण में vivo centrifugation

Tran, S. L., Welte, M. A. In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (40), e2005, doi:10.3791/2005 (2010).

शुद्ध और intracellular organelles के विभिन्न प्रकार के अलग करने के लिए एक प्रमुख रणनीति के लिए उन्हें एक दूसरे से प्रसन्नचित्त घनत्व में अंतर के आधार पर अलग है. हालांकि, जब कोशिकाओं को पहले centrifugation, प्रोटीन, और गैर देशी इस माहौल में organelles बाधित कर रहे हैं अक्सर अनुपयुक्त एक दूसरे से चिपके रहते हैं. यहाँ हम बरकरार है, रहने वाले ड्रोसोफिला भ्रूण में घनत्व से अलग organelles के लिए एक विधि का वर्णन. Cellularization पहले प्रारंभिक भ्रूण जनसंख्या पिंजरों से काटा जाता है, और उनके बाहरी अंडे के गोले 50% ब्लीच के साथ इलाज के द्वारा हटा रहे हैं. भ्रूण तो एक छोटे से अगर प्लेट और डाला, पीछे के अंत करने के लिए पहली बार अगर में छोटे ऊर्ध्वाधर छेद में हस्तांतरित. एम्बेडेड भ्रूण युक्त प्लेटें 3000g पर 30 मिनट के लिए centrifuged हैं. अगर भ्रूण का समर्थन करता है और उन्हें एक परिभाषित अभिविन्यास में रहता है. बाद में, भ्रूण अगर के बाहर एक मुँहफट सुई के साथ खोदा हैं.

Centrifugation प्रमुख organelles अलग अलग परतों में एक स्तरीकरण आसानी से उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई. फ्लोरोसेंट मार्करों का एक संख्या में जीवित भ्रूण में सफल स्तरीकरण की पुष्टि के लिए उपलब्ध हैं. कुछ organelles के साथ जुड़े प्रोटीन एक विशेष परत में समृद्ध हो जाएगा, colocalization प्रदर्शन. जैव रासायनिक विश्लेषण या दाता अंडे में प्रत्यारोपण के लिए व्यक्तिगत परतों बरामद किया जा सकता है. इस तकनीक विविध प्रजातियों के अंडे और oocytes सहित अन्य बड़े कोशिकाओं में organelle जुदाई लिए लागू होता है.

1) अगर प्लेटों की तैयारी

अवलोकन: इस प्रोटोकॉल के दो अलग - अलग का उपयोग करता है के लिए अगर प्लेटें कार्यरत हैं . सबसे पहले, अगर प्लेटें अंडे संग्रह सतह के रूप में सेवा करते हैं, अगर में सेब का रस बिछाने अंडे उत्तेजित करता है. दूसरा, अगर में एम्बेडेड भ्रूण एक निश्चित अभिविन्यास में आयोजित की जाती हैं जब प्लेटें centrifuged हैं, अगर एक पर्याप्त उच्च एकाग्रता centrifugation दौरान बिखरने से प्लेटों को रोकने के लिए आवश्यक है. सादगी के लिए, सेब का रस अगर एक प्रकार दोनों का उपयोग करता है के लिए कार्यरत है.

माल

• अग्रवाल (25 ग्राम)
• Sucrose (25 ग्राम)
• सेब का रस (250 मिलीलीटर)
• Nipagin एम स्टॉक (50 मिलीलीटर इथेनॉल में पाँच छ मिथाइल-P-hydroxy-बेंजोएट) समाधान, एक संरक्षक के रूप में कार्य करता है
• Centrifugation (60x15mm) के लिए और अंडे संग्रह (60x15 मिमी या 100x15 मिमी, मक्खी चरण 2 में प्रयुक्त पिंजरों के आधार पर) के लिए: पेट्री डिश

उपकरण

• होट प्लैट
• दो Erlenmeyer बोतल

1. एक Erlenmeyer फ्लास्क में 25 ग्राम अगर और 750 मिलीलीटर DH ₂ ओ गठबंधन तरल चक्र पर 50 मिनट के लिए आटोक्लेव. मतलब समय में, सेब का रस समाधान (1.2 कदम) तैयार करते हैं.
2. दूसरे Erlenmeyer फ्लास्क में 25 ग्राम sucrose और सेब के रस के 250 मिलीलीटर गठबंधन. गर्म थाली पर हीट (लगभग 55 डिग्री सेल्सियस) sucrose भंग करने के लिए. फिर 15 मिलीलीटर Nipagin एम समाधान जोड़ें. उच्च तापमान से बचें, के रूप में वे Nipagin नीचे तोड़ने के लिए कारण होगा.
3. एक बार अगर समाधान काफी ठंडा हो गया है कि फ्लास्क हाथ से संभाला जा सकता है है, दो समाधान गठबंधन और मिश्रण अच्छी तरह से. गर्म थाली पर हलचल जब तक समान रूप से मिश्रित.
4. पेट्री डिश (~ 0.5 सेमी उच्च) में समाधान डालो. समाधान का 1 लीटर के बारे में छोटे 100 (60 मिमी व्यास) या 40 बड़े बर्तन (100 मिमी व्यास) के लिए पर्याप्त है.
5. अग्रवाल प्लेटें कमरे के तापमान पर कई घंटे या रातोंरात के लिए सूखी चाहिए, अन्यथा वे भी उपयोग के लिए गीला हो जाएगा. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, रख उन्हें लिपटे 4 (प्लास्टिक के डिब्बे या पेट्री डिश आस्तीन में) में डिग्री सेल्सियस

2) फसल काटने वाले भ्रूण

अवलोकन: विकास के पहले 3 घंटे के दौरान (कमरे के तापमान पर), ड्रोसोफिला भ्रूण एकल कक्षों (रोगाणु लाइन व्यापारियों, पीछे स्थित पोल कोशिकाओं की गिनती नहीं) कर रहे हैं . जब इन चरणों का ठीक से उन्मुख भ्रूण centrifuged हैं, प्रमुख अंडे की लंबी अक्ष के साथ घनत्व द्वारा अलग organelles. Cellularization स्तर पर, इस बड़े एकल कक्ष छोटे कोशिकाओं के हजारों में बदल जाती है, centrifugation कार्यरत बलों टूटना इन कोशिकाओं नहीं होगा. प्रमुख organelles के सफल अलगाव के लिए, यह इसलिए भ्रूण कि अभी तक cellularization पूरा नहीं किया है अपकेंद्रित्र के लिए महत्वपूर्ण है.

माल

• सेब का रस अगर प्लेटें
• खमीर पेस्ट (सूखी खमीर मूंगफली मक्खन की निरंतरता को पानी के साथ मिश्रित)

उपकरण

• पिंजरों फ्लाई: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है (नीचे देखें) या ^एक घर बनाया

1. प्रौढ़ मक्खियों पिंजरों तल पर सेब का रस अगर प्लेटें चिपका रहे हैं जो में रखा जाता है. पेट्री उपयोग में पिंजरों के लिए उपयुक्त व्यंजन का एक आकार का उपयोग करें.
2. एक अंडा संग्रह शुरू करने के लिए, एक ताजा सेब का रस अगर थाली तैयार करने और खमीर पेस्ट के साथ एक हिस्से को कवर. फल मक्खियों खाने खमीर, विशेष रूप में, खमीर अंडा उत्पादन के लिए पोषण प्रदान करता है. और अगर में सेब का रस खमीर की उपस्थिति भी अंडे बिछाने लाती है.
3. नया अगर प्लेट के साथ पुराने का आदान - प्रदान के लिए, मक्खी पिंजरे उलटा है और बेंच शीर्ष पर कुछ समय टक्कर लगी है. मक्खियों नीचे गिर रहे हैं और संक्षिप्त disoriented. कि तुम कुछ ही सेकंड के लिए जल्दी से एक अगर प्लेट हटा दें और इसे एक ताजा के साथ एक जगह देता है. यह मुद्रा कुछ अभ्यास लेता है, और विवरण कार्यरत पिंजरे के प्रकार पर निर्भर करती है.
4. महिला आंतरिक पाउच में पिछले matings (spermathecae) ​​जिसमें से शुक्राणु को अंडे के निषेचन की अनुमति जारी की है से दुकान शुक्राणु मक्खियों. जब अच्छी तरह से तंग आ गया और undisturbed, महिलाओं में निषेचन के बाद शीघ्र ही अंडे देते हैं, और इस प्रकार अंडे बिछाने के समय निषेचन और विकास की शुरुआत के समय के निशान. जब शर्तों इष्टतम नहीं कर रहे हैं, महिलाओं को बिछाने से पहले चर समय के लिए निषेचित अंडे पकड़. जैसे गलत मंचन किया भ्रूण की संख्या को कम करने के लिए, यह सलाह दी जाती है कार्यदिवस के पहले संग्रह (30 से 60 मिनट की एक "पूर्व - संग्रह" पर्याप्त है) त्यागें. ताजा खमीर की उपस्थिति इन आयोजित अंडे देना महिलाओं लाती है, और बाद अंडे संग्रह अंडे का प्रभुत्व हो जाते हैं निषेचन के बाद शीघ्र ही जमा है.
5. 3 घंटे के लिए अंडे निर्भर करता है जिस पर भ्रूण चरण में वांछित है, ले लीजिए. के बाद से कमरे के तापमान cellularization पर ~ 3.5 घंटे के बाद पूरा हो गया है, अब संग्रह बार उपयोगी नहीं हैं. सबसे लगातार layering युवा भ्रूण में हासिल की है, तो दिनचर्या के प्रयोगों के लिए हम कम संग्रह बार एहसान (1 घंटाया कम).
6. कभी कभी मक्खियों खमीर या अगर प्लेट की सतह के लिए अटक जाते हैं. उन्हें चिमटी के साथ निकालें.

3) भ्रूण से अंडे के खोल को हटाना

अवलोकन: एक बाहरी परत (chorion) प्रोटीन और एक भीतरी परत (vitelline झिल्ली) से बना predominately मोम की बाहर कर दिया: ड्रोसोफिला भ्रूण दो सुरक्षा परतों द्वारा कवर कर रहे हैं. वे यांत्रिक अपमान और desiccation के खिलाफ भ्रूण की रक्षा करना. chorion दो (अंडे filaments या पृष्ठीय appendages) एक्सटेंशन है कि आसानी से अलग संरचनाओं के रूप में दिखाई दे रहे हैं. इस चरण में, हम 50% ब्लीच में अंडे भिगोने द्वारा chorion निकाल देंगे. एक बार chorion निकाल दिया जाता है, भ्रूण प्रेषित प्रकाश में पारदर्शी हो जाता है, centrifugation के लिए विशिष्ट भ्रूण चरणों के चयन की अनुमति है. के रूप में chorion भी कई पोस्ट centrifugation प्रक्रियाओं (जैसे, चरण 6 में नियतन) के साथ हस्तक्षेप करेगा, chorion को हटाने अब जल्दी प्रसंस्करण के बाद की अनुमति होगी.

50% ब्लीच इलाज के कुछ ही मिनटों के भीतर chorion भंग, अभी तक यह भ्रूण को नुकसान नहीं करता है. vitelline झिल्ली ब्लीच बाहर रहता है. हम ब्लीच उपचार जारी जब तक अंडे filaments अब दिखाई दे रहे हैं. बाद में, हम एक छोटे से चलनी (एक तार की जाली बना टोकरी) के माध्यम से घोल / भ्रूण ब्लीच गिरने से ब्लीच से भ्रूण अलग कर देगा. यह महत्वपूर्ण है के लिए ब्लीच जोखिम कदम जल्दी नहीं है. यदि ब्लीच से समय से पहले, बाद में चरणों को धोया जाता है (उदाहरण के लिए, vitelline झिल्ली निम्नलिखित निर्धारण के हटाने) समझौता किया जा सकता है.

सामग्री:

• 50% ब्लीच के साथ धारा निकलना बोतल (एक मात्रा DH ₂ एक मात्रा वाणिज्यिक ब्लीच हे)
• DH ₂ हे के साथ धारा निकलना बोतल
• कागज तौलिया

उपकरण:

• घर का तार टोकरी स्टेनलेस स्टील वायर जाल की चादरों से बाहर कर दिया. टोकरी बनाने के लिए, ~ x 2 सेमी फ्लैट शीट से बाहर 2 के वर्गों में कटौती और उन्हें बीच में इंडेंट.
• चिमटी तार टोकरी पकड़
• विदारक माइक्रोस्कोप transillumination के लिए स्थापित

1. एक विदारक खुर्दबीन के तहत अगर थाली प्लेस और transillumination द्वारा भ्रूण निरीक्षण. अंडे filaments की पहचान (चित्रा 2A देखें) सुनिश्चित करें.
2. अगर प्लेट पर धारा निकलना 50% ब्लीच, भ्रूण को कवर. कभी - कभी अगर थाली आंदोलन ब्लीच में भ्रूण के आसपास ज़ुल्फ़.
3. एक बार अंडे filaments नहीं रह (3-5 मिनट के बाद आम तौर पर, लेकिन कई बार भिन्न हो सकते हैं) दिखाई दे रहे हैं, chorion सफलतापूर्वक हटा दिया गया है.
4. अगले चरण में, एक तार जाल टोकरी चलनी के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ब्लीच से भ्रूण अलग. चिमटी के साथ तार टोकरी ले लो और यह अगर प्लेट के उल्टे कवर पर पकड़. कवर जलाशय के रूप में सेवा करने के लिए तार जाल के माध्यम से टपकता ब्लीच को पकड़ने होगा.
5. अगर थाली से तार की जाली के माध्यम से घोल / ब्लीच भ्रूण डालो.
6. यदि भ्रूण की एक महत्वपूर्ण संख्या की थाली पर अगर थाली, धार DH हे ₂ पर रहेगा और तार जाल के माध्यम _{से DH} 2 हे / भ्रूण घोल डाल. यदि भ्रूण की एक महत्वपूर्ण संख्या में जलाशय में से बाहर हो जाना, तार जाल के माध्यम से जलाशय सामग्री डाल.
7. एक कागज तौलिया के लिए तार जाल के नीचे टच को दूर किसी भी अतिरिक्त तरल दाग. फिर धार DH ₂ हे तार की जाली पर बंद शेष ब्लीच कुल्ला करने के लिए. जैसा ऊपर वर्णित है, कवर की थाली जलाशय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए किसी भी गलती से धोया भ्रूण को ठीक. आप तार टोकरी की परिधि के साथ धार बोतल से पानी की धारा की ओर इशारा करते हुए भ्रूण को खोने को कम कर सकते हैं. अकसर अतिरिक्त तरल दाग.
8. इस धोने कदम पांच से दस बार दोहराएँ, जब तक सभी ब्लीच हटा दिया गया है. यदि तार टोकरी अभी भी ब्लीच की बदबू आ रही है, वाशिंग जारी रखना चाहिए.

अगर में) 4 बढ़ते भ्रूण

अवलोकन: ड्रोसोफिला अंडे अब व्यापक (~ 180 सुक्ष्ममापी) की तुलना में (~ 500 सुक्ष्ममापी) ज्यादा हैं. Centrifugation दौरान organelles के अधिक से अधिक और लगातार जुदाई, हम पूरबी भ्रूण ऐसी है कि उनके रोटेशन के केंद्र की ओर पूर्वकाल समाप्त होता बिंदु (चित्रा 1, 3). इस तरह, lightest intracellular संरचना (लिपिड बूंदों) सभी भ्रूण में पूर्वकाल अंत में जमा है, जबकि बहुत घने संरचनाओं (जर्दी घटकों) पीछे के अंत के पास जमा है. भ्रूण सेब का रस अगर में छोटे ऊर्ध्वाधर छेद में डाला जाता है, पूर्वकाल समाप्त होता है चिपका के साथ. अगर centrifugation के दौरान एक निश्चित अभिविन्यास में भ्रूण रहता है.

उपकरण:

• सुई धारक
• टंगस्टन सुई, सुई धारक में विशिष्ट अभिविन्यास से पीछे की ओर बढ़ रहे हैं, इसलिए है कि कुंद अंत से चिपक जाती है और भ्रूण में हेरफेर करने के लिए उपलब्ध है
• P200 pipettor
• विदारक माइक्रोस्कोप transilluminatio के लिए स्थापितपता
• फ्लाई ब्रश (छोटे पेंट ब्रश के लिए वयस्क ड्रोसोफिला सॉर्ट किया)

सामग्री:

• ट्राइटन साल्ट (TSS) समाधान: 4g NaCl, 0.3 मिलीलीटर ट्राइटन X-100, DDH ₂ हे के साथ 1000 मिलीलीटर को भरने के लिए (एक 10x शेयर समाधान के रूप में बनाया जा सकता है है)

1. भ्रूण धो बाहर TSS के साथ और एक खाली पेट्री डिश में तार टोकरी. भ्रूण नीचे सिंक चाहिए. एक विदारक गुंजाइश पर पेट्री TSS में भ्रूण युक्त पकवान स्थानांतरण और transillumination द्वारा निरीक्षण (भ्रूण चित्रा 4 में चित्रित उन लोगों के लिए समान दिखेगा).
2. एक P200 pipettor का प्रयोग, वांछित चरणों के भ्रूण का चयन करें और उन्हें एक छोटे से अगर प्लेट को हस्तांतरण. विशिष्ट चरणों आसानी से नेत्रहीन पहचाना जा सकता है है (चित्रा 4, और अधिक विस्तार के ^लिए, 1 देखें) . जल्दी से काम के बाद भ्रूण की उम्र बढ़ने और डुबकी TSS में लंबे समय तक (30 मिनट से अधिक समय) विकास को प्रभावित कर सकता है.
3. एक विंदुक और एक Kimwipe के साथ सबसे अधिक TSS निकालें. अगर की सतह थोड़ा नम है जो यह आसान भ्रूण पुश करने के लिए चारों ओर बनाता होना चाहिए. हालांकि, वहाँ की थाली पर कहीं भी शेष तरल centrifugation के दौरान अतिरिक्त तरल के बाद से भ्रूण छेद के बाहर स्लाइड के लिए कारण होगा के पूल नहीं होना चाहिए.
4. एक सुई का प्रयोग, जहाँ भी एक भ्रूण स्थित है के पास अगर में ऊर्ध्वाधर छेद प्रहार. यह मुश्किल है क्योंकि तुम एक कोण पर सुई पकड़ के लिए एक साथ खुर्दबीन के नीचे देखने के लिए सक्षम होना छेद है कि पूरी तरह से खड़ी हैं प्रहार. सुई की एक मामूली झुकाव वास्तव में फायदेमंद है क्योंकि इस छेद के एक तरफ एक मामूली अवसाद / ग्रोव बनाता है इतना है कि भ्रूण आसानी से इसके साथ और छेद में स्लाइड होगा. यह अगर की सतह पंचर करने के लिए पर्याप्त है क्योंकि अगर काफी नरम है कि एक बार एक भ्रूण आंशिक रूप से यह क्षति के बिना आगे धक्का दिया जा सकता है एक छेद में डाला जाता है.
5. सुनिश्चित करें कि आप भ्रूण की पूर्वकाल और कूल्हों समाप्त होता है की पहचान के रूप में भ्रूण एक सुसंगत ओरिएंटेशन में छेद में धकेल दिया जाना चाहिए, आमतौर पर पूर्वकाल अंत के साथ. vitelline झिल्ली पूर्वकाल अंत में एक विशेष संरचना की विशेषता है, micropyle (चित्रा 2), जिसके माध्यम से शुक्राणु निषेचन के दौरान प्रवेश करती है.
6. सुई की कुंद अंत का उपयोग करके, आप भ्रूण के खिलाफ पुश करने के लिए इसे अगर साथ कदम और / एक हवा निकाल छेद की ओर उन्मुख करने के लिए अपने पीछे अंत पैंतरेबाज़ी कर सकते हैं. फिर छेद की ओर पूर्वकाल अंत के खिलाफ धक्का. यह आसानी से मामूली puncturing के दौरान उत्पन्न अवसाद के साथ छेद में भ्रूण सरकना चाहिए. के रूप में भ्रूण tilts, यह छेद में गहरी नीचे धक्का.
7. जब पूरी तरह में धकेल दिया, भ्रूण आम तौर पर पहले से ही काफी ऊर्ध्वाधर. यदि नहीं, तो आप उस पर sidewise धकेलने के द्वारा डाला भ्रूण अधिक खड़ी संरेखित कर सकते हैं. यदि छेद बहुत बड़ा नहीं है, भ्रूण की स्थिति stably centrifugation भर में अगर द्वारा आयोजित किया जाएगा.
8. अभ्यास के साथ, यह संभव है प्लेट प्रति 100-250 भ्रूण एम्बेड. यह विशेष रूप से आवेदन कितने की जरूरत है पर निर्भर करेगा: यदि भ्रूण रहते इमेजिंग के लिए या प्रत्यारोपण के प्रयोगों के लिए दाताओं के रूप में उपयोग किया जाता है, केवल कुछ आवश्यक हैं. यदि भ्रूण तय की और immunostained हैं, एक अंश के बाद centrifugation प्रसंस्करण के दौरान खो जाएगा, और एक उच्च संख्या के साथ शुरू किया है. ध्यान रखें कि भ्रूण को इतनी बढ़ते अगर एक संकीर्ण विकास मंच वांछित है, बढ़ते की जरूरत के लिए कुल समय कम रखा के दौरान विकास जारी है.
9. अगर वहाँ किसी भी भ्रूण बचे हुए है कि नहीं थे एम्बेडेड रहे हैं, एक सिक्त मक्खी ब्रश के साथ थाली से उन्हें हटा दें. तरल में मक्खी ब्रश (जैसे 1xTSS) डुबकी, ध्यान से प्लेट के ऊपर भर पोंछ (जबकि विदारक गुंजाइश के तहत देख) के लिए किसी भी बचे हुए भ्रूण झाडू, और भ्रूण धोने ब्रश के तरल में ब्रश फिर से सूई से बाहर.

5) centrifugation और भ्रूण की वसूली

अवलोकन: प्लेटें RT7 Sorvall प्लस अपकेंद्रित्र के झूलते बाल्टी के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और 30 मिनट के लिए 4000 rpm है, जो ~~ 3000 जी से मेल खाती है पर centrifuged Centrifugation के बाद, प्लेटें TSS के साथ कवर कर रहे हैं. एक सुई के साथ, भ्रूण अगर में छेद के बाहर खोदा कर रहे हैं और एक pipettor के माध्यम से उपयुक्त वाहिकाओं में स्थानांतरित.

उपकरण:

• सुई के साथ सुई धारक (के रूप में पहले)
• प्लस RTH750 रोटर और झूल बाल्टी के साथ Sorvall RT7, या ^{समकक्ष} 2
• विदारक माइक्रोस्कोप transillumination के लिए स्थापित
• P200 pipettor

सामग्री:

• TSS

1. अपकेंद्रित्र, अगर नीचे की ओर झूलते बाल्टी प्लेटें स्थानांतरण. सुनिश्चित करें कि अपकेंद्रित्र समान रूप से संतुलित है.
2. Centrifugation के लिए सेटिंग्स: = तापमान 4-10 डिग्री सेल्सियस से, rpm = 4000 समय = 30 मिनट है.
3. Centrifugation विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत, जगह अगर फिर थाली के बाद और टीएसएस की एक परत के साथ प्लेट को कवर.
4. ख का उपयोगसुई के Lunt अंत, भ्रूण अपने छेद से बाहर खुदाई. वे TSS में तैरने लगते हैं, लेकिन जलमग्न रहेगा.
5. भ्रूण जाहिर स्तरित पूर्वकाल अंत में एक भूरे रंग की टोपी, एक स्पष्ट मध्य क्षेत्र, और, पीछे अंत में एक अंधेरे ग्रे क्षेत्र (चित्रा 2, 5A) के साथ दिखाई देगा. भ्रूण को त्यागें है कि अलग layering दिखाने के लिए असफल.
6. एक P200 pipettor का प्रयोग, TSS में एक नए पोत के लिए अच्छी तरह से स्तरित भ्रूण स्थानांतरण आवेदन के आधार पर एक जगमगाहट शीशी या microcentrifuge ट्यूब, जैसे.

6) इसके अलावा प्रसंस्करण

आवेदन पर निर्भर करता है, भ्रूण बाद में विभिन्न तरीकों से इलाज किया जाएगा.

1. उज्ज्वल क्षेत्र या epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यक्ष प्रेक्षण के लिए, भ्रूण बफर में एक गिलास स्लाइड के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, और spacers के रूप में # 1 coverslips 18x18 मिमी के साथ एक 22x22 मिमी # 1.5 coverslip के तहत मुहिम शुरू की. लंबी अवधि टिप्पणियों के लिए, यह हेलोकार्बन 27 तेल के साथ बफर बदलने के लिए आवश्यक हो सकता है.
2. यदि भ्रूण तय होने हैं, वे 5.6 चरण में एक जगमगाहट शीशी के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए. वे तो मानक निर्धारण ^एक तकनीक का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है. इन तकनीकों में आमतौर पर एक मेथनॉल हेपटैन पायस में आंदोलन को रोजगार के लिए vitelline झिल्ली को हटा दें. ध्यान दें कि centrifuged भ्रूण के लिए इस devitellinization कदम की क्षमता कम है. इसलिए यह उचित है व्यावहारिक रूप के रूप में कई भ्रूण के साथ शुरू करने के लिए ^या vitelline झिल्ली के हटाने के एक मैन्युअल.
3. यदि भ्रूण प्रत्यारोपण (जैसे, centrifuged भ्रूण से एक विशेष organelle परत को हटा दें) प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा, वे अगर प्लेटों को स्थानांतरित कर रहे हैं और coverslips पर घुड़सवार, ^{uncentrifuged} 3 भ्रूण के लिए के रूप में मानक प्रक्रियाओं का उपयोग. centrifugation द्वारा प्रेरित layering मिनट के दसियों के लिए स्थिर है.

7) प्रतिनिधि के परिणाम

यदि centrifugation काम के रूप में की उम्मीद, प्रमुख भ्रूण organelles ² घनत्व से बाहर तरह का होगा. उदाहरण के लिए, कम घनत्व लिपिड बूंदों पूर्वकाल अंत में जमा करेंगे, उच्च घनत्व की जर्दी vesicles के पीछे अंत (चित्रा 1, 2) पर जमा करेंगे. लिपिड बूंदों और जर्दी vesicles लिपिड और प्रोटीन के लिए भंडारण organelles हैं.

विदारक या यौगिक सूक्ष्मदर्शी के तहत घनत्व पर निर्भर स्तरीकरण की पुष्टि transillumination द्वारा जीवित भ्रूण के दृश्य निरीक्षण के माध्यम से हासिल की है. भ्रूण के रूप में चित्रा 5A में दिखाई देनी चाहिए: लिपिड बूंदों बहुत पूर्वकाल टिप (एक "लिपिड टोपी") पर एक ठोस परत भूरे रंग के रूप में होगा, जर्दी संचय एक अंधेरे ग्रे क्षेत्र में पीछे अंत में परिणाम देगा. इन दो अंधेरे परतें एक व्यापक स्पष्ट क्षेत्र है कि अन्य organelles और cytoplasm का प्रतिनिधित्व करता है के द्वारा अलग कर रहे हैं. यदि भ्रूण cellularization के बाद centrifuged हैं, layering के कम से कम हो सकता है (चित्रा 5C).

यदि एक epifluorescence माइक्रोस्कोप उपलब्ध है, इन में रहने वाले, centrifuged भ्रूण यूवी उत्तेजना के तहत जांच की जा सकती है. इन शर्तों के तहत, जर्दी तीव्र नीले autofluorescence (चित्रा 5B) प्रदर्शित करता है. पीछे ध्रुव पर एक autofluorescent सामग्री की कॉम्पैक्ट परत सफल centrifugation इंगित करता है और पीछे के अंत के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य करता है.

ध्यान दें कि इन परतों की उपस्थिति काफी बदल अगर भ्रूण तय कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, जब भ्रूण मानक गर्मी या formaldehyde के निर्धारण के द्वारा तय कर रहे हैं हेपटैन - ^{मेथनॉल} 1 devitellinization द्वारा पीछा किया, लिपिड बूंदों पारदर्शी हो जाते हैं और लिपिड परत सफेद और उज्ज्वल प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा शराबी बजाय गहरे भूरे (चित्र 5D), प्रकट होता है. जर्दी autofluorescence आंशिक रूप से या पूरी तरह निर्धारण द्वारा नष्ट कर दिया है, और बहुत कम तीव्र या भी undetectable बनने है.

यदि इन विवो centrifugation एक विशेष organelle को उजागर करने के लिए कार्यरत है, यह लेबल करने के लिए उपयोगी है कि पुष्टि करने के लिए एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ organelle. उदाहरण के लिए, YFP संलयन mitochondria में लक्षित प्रोटीन, ईआर या Golgi ⁴ में वर्णित किया गया है. Centrifuged भ्रूण में, इन मार्करों पूर्वकाल पीछे (चित्रा 1) अक्ष के साथ विशेषता पदों पर जमा. अंत में, कुछ histone संलयन प्रोटीन लिपिड बूंदों और नाभिक ² दोनों स्थानीयकरण, और इस प्रकार इन सेलुलर डिब्बों (चित्रा 5 एफ ई,) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से निशान भ्रूण के मंच पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (लेबल नाभिक की संख्या के द्वारा) . फ्लाई इस पैरा में उल्लेख किया मार्करों व्यक्त उपभेदों ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र (http://flystocks.bio.indiana.edu/) से उपलब्ध हैं. Histone H2Av के लिए, दोनों GFP और mRFP वेरिएंट उपलब्ध हैं ^{6 5,}

चित्रा 1 centrifugation द्वारा organelles ⁽² के बाद संशोधित) के पृथक्करण. अलग स्तरीकरण उन्मुख भ्रूण परिणाम के centrifugation(चमकदार रोशनी). - मेजर organelles पूर्वकाल साथ विशेषता पदों (अप) में जमा, endoplasmic जालिका, Golgi, और mitochondria (YFP में वर्णित मार्करों के माध्यम से जीवित भ्रूण में पाया लिपिड बूंदों (नील लाल धुंधला द्वारा तय भ्रूण में पाया): पीछे (नीचे) अक्ष मुख्य) पाठ; जर्दी (autofluorescence के द्वारा पाया). प्रतिदीप्ति छवियों confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत किया गया.

चित्रा 2 भ्रूण की योजनाबद्ध चित्रण.

ए अंडा अंडा खोल और प्रमुख अंडा filaments (पृष्ठीय appendages के) के साथ. के रूप में अंडा खोल पारदर्शी नहीं है, अंडा समान अंधेरा दिखाई देता है.

Chorion साथ बी अंडे को हटा दिया. पूर्वकाल अंत में (बाएं), micropyle दिख रहा है. विकास के चरण पर निर्भर करता है, vitelline झिल्ली के अंदर भ्रूण के समान काले भूरे रंग दिखाई देते हैं या विभिन्न संरचनाओं को दिखाने. Figure4 उदाहरण के लिए देखें.

सी. भ्रूण Centrifuged, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के रूप में उन्मुख. लिपिड बूंदों micropyle अंत में एक भूरे रंग के "टोपी" के रूप में संचित, जर्दी विपरीत अंत में या निकट एक ग्रे परत रूपों.

चित्रा 3 प्रक्रिया के योजनाबद्ध वर्णन. वाम: chorion बिना भ्रूण अगर प्लेट के ऊपर पर रखा जाता है और अगर में छेद में एक सुई के साथ धक्का दिया. यह सभी भ्रूण की एक सुसंगत ओरिएंटेशन में परिणाम पूर्वकाल साथ, बढ़ते समाप्त होता है. अधिकार: centrifugation के बाद, भ्रूण स्तरीकृत हैं. अग्रवाल TSS (नीला) के साथ overlaid है, और भ्रूण सुई के साथ अगर से बरामद कर रहे हैं. एक बार TSS में निलंबित कर दिया है, भ्रूण pipettor साथ हो उठाया जा सकता है.

चित्रा 4. रहने वाले ड्रोसोफिला भ्रूण के तेज प्रकाश छवियों, कैसे वे 4.1 चरण में दिखाई देगा करने के लिए इसी तरह की. भ्रूण मानक ओरिएंटेशन में दिखाया जाता है: बाएँ, ठीक है, पृष्ठीय पक्ष अप, और उदर की ओर नीचे करने के लिए पीछे के अंत करने के लिए पूर्वकाल अंत है. जल्दी embryogenesis की एक फिल्म समय चूक वीडियो के भाग के रूप में इस प्रोटोकॉल के साथ उपलब्ध है.

ए विखंडन चरण भ्रूण समान भूरे रंग के दिखाई देते हैं. इस तरह चरणों में vivo centrifugation के लिए आदर्श होते हैं .

बी Blastoderm भ्रूण एक स्पष्ट रिम है कि सभी पक्षों पर समान प्रतीत होता है. यह स्पष्ट परिधि नाभिक के प्लाज्मा झिल्ली में संचय के कारण भाग में और जर्दी vesicles और लिपिड बूंदों ⁷ की आवक परिवहन की वजह से भाग में है. यह स्पष्ट परिधि cellularization ¹ के अंत के पास जब तक फैलता है . भ्रूण अभी भी सफलतापूर्वक centrifugation द्वारा स्तरीकृत किया जा सकता है cellularization ⁸ के अंत तक, हालांकि जर्दी और नाभिक के layering के रूप में दरार चरणों में के रूप में संगत नहीं है.

सी. cellularization के बाद, भ्रूण असममित दिखाई देते हैं; पृष्ठीय और उदर पक्षों अलग हो जाते हैं, और विभिन्न परतों विकसित. दिखाया भ्रूण जल्दी विस्तार रोगाणु बैंड में है. इन चरणों में, centrifugation अब प्रमुख organelles stratifying पर प्रभावी है.

चित्रा 5 Centrifuged भ्रूण. उनके पूर्वकाल अंत के साथ इस आंकड़े में सभी भ्रूण centrifuged थे और हैं कि अभिविन्यास में दिखाया गया है.

ए उज्ज्वल प्रकाश भ्रूण सफलतापूर्वक centrifuged की छवि. बहुत पूर्वकाल अंत में एक भूरे रंग परत लिपिड छोटी बूंद - संचय के कारण है. पीछे के अंत के पास एक व्यापक ग्रे परत जर्दी vesicles के कारण है. वहाँ अक्सर जर्दी परत के नीचे एक अज्ञात मूल के स्पष्ट क्षेत्र है. एक पीले क्षेत्र अक्सर जर्दी परत के ऊपर स्पष्ट है, यह शायद mitochondria का प्रतिनिधित्व करता है. घुलनशील प्रोटीन लिपिड बूंदों और जर्दी ² के बीच स्पष्ट परत भर में पाए जाते हैं.

बी एक में भ्रूण यूवी उत्तेजना के तहत epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा. नीले autofluorescence विशेषता की जर्दी के पीछे के अंत की पहचान करने में मदद करता है.

सी. भ्रूण रोगाणु बैंड विस्तार, अर्थात् के दौरान cellularization के बाद, centrifuged. जर्दी अभी भी पीछे अंत में जमा सकता है, लेकिन अन्यथा layering न्यूनतम है.

डी. गर्मी निर्धारण के बाद सफलतापूर्वक स्तरीकृत भ्रूण,. लिपिड - छोटी बूंद परत सफेद और शराबी है, unfixed भ्रूण के रूप में काले भूरे रंग (ए) के बजाय, प्रकट होता है.

ई. एंड एफ भ्रूण confocal माइक्रोस्कोपी ⁽² के बाद संशोधित) द्वारा His2Av GFP और imaged व्यक्त. ई: दरार चरणों में centrifuged, His2Av - GFP केवल लिपिड - छोटी बूंद परत निशान के बाद से इस समय से कुछ नाभिक का गठन कर रहे हैं प्रकट होता है. फोकल हवाई जहाज़ पर निर्भर करता है, नाभिक छोटी बूंद परत के नीचे दिखाई दे सकता है (यहाँ दिखाया नहीं) हो सकता है. एफ: blastoderm चरणों में centrifuged, His2Av - GFP दोनों लिपिड छोटी बूंद (ऊपर) परत और नाभिक (छोटी बूंद परत के नीचे एक व्यापक क्षेत्र में) के निशान है.

महत्वपूर्ण कदम

यकीन है कि अगर एकाग्रता पर्याप्त उच्च है यदि यह बहुत कम है. अगर centrifugation के दौरान बिखर, और भ्रूण फट या अनियमित उन्मुख हो जाएगा . यदि अगर एकाग्रता बस थोड़ा बहुत कम है या यदि अगर गीला है (4.3 चरण में अतिरिक्त टीएसएस की अपर्याप्त सूखे या अपर्याप्त हटाने), भ्रूण बाहर अपने छेद के centrifugation के दौरान नाव को अनुचित तरीके से उन्मुख हो जाते हैं. यदि अगर बहुत बारीकी डाला है, यह भी पतन या centrifugation के दौरान दरार.

सुनिश्चित करें कि भ्रूण cellularization चरणों से परे उन्नत है अन्यथा बनाओ. Organelles की जुदाई (छवि 5C) काम नहीं के बाद से व्यक्ति की कोशिकाओं के हजारों के भीतर organelles तनहा हो जाएगा . एक सेल स्तर पर युवा भ्रूण में, organelles बड़ी दूरी को विस्थापित करने के लिए स्वतंत्र हैं और उनकी विशेषता घनत्व के अनुसार जमा. भ्रूण है कि बहुत पुराने हैं विश्लेषण से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि (i) के एक पूर्व संग्रह शामिल करने के लिए महिलाओं को पुराने अंडे (2.4 कदम), (ii) 3 घंटे या उससे कम के लिए भ्रूण एकत्र (2.5 कदम), (iii) का पालन करने की अनुमति नेत्रहीन cellularization चरणों से पहले अगर में एम्बेड करने के लिए भ्रूण का चयन करें (4.2 कदम), (iv) कम समय cellularization (4.6 कदम) के अंत के माध्यम से विकास को रोकने एम्बेड रखने के लिए, और (v) भ्रूण कि परत नहीं सही त्यागें (5.6 कदम) .

Centrifugation समय पर कंजूसी मत करो हालांकि भ्रूण की centrifugation के केवल 10 मिनट के बाद भी कुछ अच्छा layering दिखाएगा, जुदाई भ्रूण से भ्रूण असंगत है . 30 मिनट spins अत्यधिक अनुरूप परिणाम दे. इसके अलावा, अब centrifugation समय, अब परतों स्थिर रहे हैं centrifugation के बाद समाप्त हो गया है. यह उन अनुप्रयोगों में जो यह करने के लिए भ्रूण उपयोग करने से पहले आगे की प्रक्रिया समय लगता है के लिए महत्वपूर्ण है (उदाहरण के लिए, अगर वे प्रत्यारोपण के प्रयोगों के लिए संसाधित हो सकता है या confocal विश्लेषण के लिए मुहिम शुरू की जरूरत है).

संभावित संशोधनों

अंडा संग्रह और chorion हटाने कई अलग प्रोटोकॉल चरण 2 और 3 ^{1, 3, 9} के लिए मौजूद हैं, और काम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लोगों को लंबे समय के रूप में यहाँ वर्णित के रूप में इस्तेमाल किया भ्रूण युवा हैं, अंडे की उपज अधिक है, और के अंश गलत मंचन भ्रूण कम से कम है.

पूर्वकाल - पीछे संरेखण प्रोटोकॉल ऐसे सभी भ्रूण कि पीछे अंत अगर में दफन है और पूर्वकाल अंत तक (3 छवि) में orients. इस अभिविन्यास स्थिरता के लिए अच्छा है, इतना है कि यह संभव है के लिए एक मील का पत्थर है जो अंत centrifugation (1 छवि, 5) के दौरान कहा के रूप में micropyle उपयोग. हालांकि, अभ्यास के साथ, यह आसान है और उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा लिपिड छोटी बूंद - जर्दी परतों की विशिष्ट उपस्थिति द्वारा centrifuged भ्रूण के उन्मुखीकरण लेने के लिए. तो यह संभव हो जाता है या तो अंत के साथ भ्रूण माउंट, इस लचीलेपन बढ़ते प्रक्रिया को गति.

Unoriented centrifugation प्रोटोकॉल का सबसे अधिक समय लेने और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण पहलू अगर (4 कदम) में भ्रूण बढ़ते है. यह प्रत्येक भ्रूण दो बार छू (एक बार यह छेद में डालने के लिए और एक बार यह centrifugation के बाद ठीक करने के लिए) की आवश्यकता है. एक विकल्प के रूप में, एक microcentrifuge TSS के साथ भरा ट्यूबों में 4.1 कदम पर भ्रूण हस्तांतरण कर सकते हैं. जब इन ट्यूबों microcentrifuge (13,000 rpm, 10-30 मिनट) में centrifuged हैं, भ्रूण को भी आम तौर पर अच्छी तरह से ^परत 10-13 जाएगा . यह परिवर्तन एक ही समय में भ्रूण की सैकड़ों की प्रक्रिया के लिए बहुत जल्दी की अनुमति देता है. हालांकि, layering के रूप में संगत नहीं है, भ्रूण के एक अंश अलग परतों बहुत उच्च centrifugation बलों (~ 16,000 छ) से ऊपर के प्रोटोकॉल में लागू होने के बावजूद विकास नहीं करता है. ज्यादा चुनौतीपूर्ण तथ्य यह है कि भ्रूण के उन्मुखीकरण चर रहा है, और एक प्रमुख भ्रूण अक्ष के लिए विभिन्न कोणों पर जुदाई का पालन कर सकते हैं. यह परिवर्तनशीलता experimenter centrifugation कैसे एक विशेष भ्रूण अपकेंद्रित्र ट्यूब में व्यवस्थित किया गया था के बाद सॉर्ट करने के लिए की आवश्यकता है. भ्रूण के सबसे घने भाग के लिए एक मार्कर के रूप में की जर्दी autofluorescence के उपयोग के साथ, यह अक्सर संभव है, हालांकि यह बहुत अभ्यास और अधिक निर्णय यह मज़बूती करने की आवश्यकता है. अगर वहाँ नमूने में पर्याप्त भ्रूण हैं, एक उन उदाहरणों में जो भ्रूण छवि में तरह की व्यवस्था की जा हुआ सॉर्ट करने में सक्षम हो सकता है. 1.

अपने अंडे खोल में भ्रूण के centrifugation यह संभव है करने के लिए 4 कदम के लिए अगर में chorion ² पहला हटाने के बिना भ्रूण एम्बेड. इस दृष्टिकोण में, संग्रह की थाली पर भ्रूण के बजाय 3.2 कदम (हेलोकार्बन chorion पारभासी बदल जाता है) में 50% ब्लीच हेलोकार्बन तेल के साथ कवर कर रहे हैं. उपयुक्त चरणों के भ्रूण का चयन कर रहे हैं और एक नया अगर चिमटी का उपयोग कर की थाली को हस्तांतरित, चिमटी, को क्षति के साथ ही अंडे filaments हथियाने के द्वाराभ्रूण उचित बचा है. भ्रूण के रूप में 4.4 चरण में 4.8 के माध्यम से एम्बेडेड हैं पूर्वकाल अंडे filaments अगर में छेद से बाहर चिपके के साथ. अंडा खोल 50% ब्लीच उपचार द्वारा हटा दिया जाता है के बाद भ्रूण centrifuged किया गया है और अगर के बाहर के रूप में 5.4 चरण में खोदा. अंडा खोल की उपस्थिति में centrifugation निर्धारण के बाद devitellinization की दर (6.2 कदम) में सुधार हो सकता है, लेकिन centrifugation के लिए सही चरणों (4.2 कदम) के चयन और अधिक चुनौतीपूर्ण है.

अनुप्रयोगों

भ्रूण centrifugation लिए colocalization प्रयोगों, यानी, अगर एक विशेष प्रोटीन एक कुछ प्रमुख organelle localizes परीक्षण करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. उदाहरण के लिए, Klar प्रोटीन जल्दी भ्रूण लिपिड बूंदों पर मौजूद है, अभी तक इस स्थानीयकरण बरकरार भ्रूण में प्रदर्शित करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. भाग में, यह है क्योंकि दोनों Klar puncta और लिपिड बूंदों भ्रूण परिधि ¹⁰ में प्रचुर मात्रा में हैं, नकली कठिन colocalization बाहर शासन करने के लिए बना है . हालांकि, एक अलग परत में centrifugation लिपिड बूंदों केंद्रित है, और इस प्रकार, Klar संकेत के साथ colocalization स्पष्ट हो जाता है ^10.

इसी तरह के विश्लेषण असंदिग्ध रूप से लिपिड बूंदों ^{8, 13-15} कुछ histones की तरह आश्चर्य की बात उदाहरण ^{सहित,} 2 और मामलों में जहां एक प्रोटीन मौजूद सर्वत्र है में अन्य प्रोटीन के स्थानीयकरण ^का प्रदर्शन, लेकिन 8 लिपिड बूंदों पर समृद्ध है. के रूप में भ्रूण विकास मंच (4.2 कदम) द्वारा नेत्रहीन चयनित कर सकते हैं, यह भी संभव है ^{लिपिड बूंदों 8,} 15 के लिए प्रोटीन के developmentally विनियमित भर्ती का पता लगाने के लिए. लिपिड बूंदों के साथ colocalization के लिए परीक्षण विशेष रूप से आसान है के बाद से लिपिड बूंदों एक नेत्रहीन अलग 'टोपी' में जमा है, आगे कोई मार्कर या तो दाग इस परत की पहचान करने की आवश्यकता है. वास्तव में, अपने आसानी और संभावित हड़ताली दृश्य के परिणाम (1 छवि, चित्र 5. डी, ई) की वजह से, हमारी प्रयोगशाला एक पहला परीक्षण है कि एक उम्मीदवार प्रोटीन लिपिड बूंदों के लिए स्थानीय है के रूप में इस तकनीक अब नियमित रोजगार. सिद्धांत रूप में, इसी तरह colocalization अध्ययन अन्य छवि में दिखाया गया organelles के लिए काम करना चाहिए. 1, और संभावना (intracellular परजीवी सहित) के लिए दूसरों जिसका वितरण centrifuged भ्रूण में अभी तक प्रलेखित किया जाना है.

चूंकि centrifugation तंग बैंड में organelles ध्यान केंद्रित है, यह एक इन organelles में समृद्ध अंश के अलगाव की सुविधा. यह दृष्टिकोण पहले से ^ही दाता 2 भ्रूण में प्रत्यारोपण के लिए लिपिड बूंदों को ठीक किया गया. यह भी संभव हो सकता है को biochemically समृद्ध अंश (उदाहरण के लिए, भ्रूण बंद ¹⁵ निर्धारण के बाद परतों को काटने के द्वारा) का विश्लेषण कर सकते हैं.

विधि यहाँ वर्णित ड्रोसोफिला भ्रूण से परे आवेदन किया है, के रूप में ^{centrifugation 16} (मेंढ़क, नेमाटोड, tunicates, एनेलिडा, समुद्र urchins, घोंघे, और Cnidarians सहित) कई अलग अलग प्रजातियों के अंडे विभक्त हो जाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी अपनी प्रयोगशाला में, हम ऊपर housefly Musca domestica ² के भ्रूण के लिए प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है और कवक कुटकी Sciara ¹⁷ coprophila और घोंघा Ilyanassa obsoleta ¹⁷ से भ्रूण के विश्लेषण में unoriented centrifugation कार्यरत है . अंत में, इस विधि भ्रूण ही सीमित नहीं है: centrifugation भी उपयोगी हो oocytes (जैसे, ड्रोसोफिला ^{2, 18} और milkweed बग Oncopeltus fasciatus ¹⁷⁾ के रूप में अन्य बड़े कोशिकाओं, विभक्त हो जाना कर सकते हैं . अलग नमूना के लिए, सटीक centrifugation स्थितियों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है: उदाहरण के लिए, 3000 ग्राम से कम 10 मिनट कुशलतापूर्वक Musca domestica ² के भ्रूण को विभक्त हो जाना करने के लिए पर्याप्त है, और अगर ज्यादा देर centrifuged है, भ्रूण निर्धारण और immunostaining के दौरान अलग तोड़ देते हैं.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

हम सामग्री की आपूर्ति Sciara coprophila और Ilyanassa obsoleta में vivo centrifugation परीक्षण, क्रमशः के लिए सुसान Gerbi, Heidi स्मिथ और डेविड लैम्बर्ट धन्यवाद . हम तकनीक और पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए Welte प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. और centrifugation में vivo परख के विकास और शोधन NIGMS द्वारा अनुदान GM64687 मुख समर्थित किया गया . छवियों छवि में दिखाया गया है. एक और चित्र. 5E, एफ पहले ² प्रकाशित किए गए थे और यहाँ कर रहे हैं अनुमति के साथ reprinted.

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