The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Pham, V. D., Palden, T., DeLong, E. F. Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries. J. Vis. Exp. (4), e201, doi:10.3791/201 (2007).
पूर्व खेती की आवश्यकता के बिना सूक्ष्मजीवों से सटे जीनोमिक दृश्यों के Metagenomic पुस्तकालयों संग्रह के बड़े टुकड़े. बनाने और स्क्रीनिंग metagenomic पुस्तकालयों के लिए एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया उत्पन्न इसलिए असभ्य माइक्रोबियल assemblages के आनुवांशिक और चयापचय गुणों में कुशल उच्च throughput जांच के लिए उपयोगी है. यहाँ कुंजी प्रोटोकॉल वीडियो है, जो हम सही एक लंबी प्रक्रिया है कि एकांतर रोबोट इंस्ट्रूमेंटेशन और (मानव) मैनुअल हस्तक्षेप पर निर्भर करता है का वर्णन करने के लिए सबसे उपयोगी प्रारूप प्रस्ताव है पर प्रस्तुत कर रहे हैं. सबसे पहले, हम रोबोटिक्स रोजगार के लिए उच्च घनत्व macroarray झिल्ली पर पुस्तकालय क्लोन, जिनमें से प्रत्येक चौबीस 384 अच्छी तरह से पुस्तकालय प्लेटें से डुप्लिकेट कालोनियों को शामिल कर सकते हैं हाजिर. स्वचालन सटीकता और गति के लिए ही नहीं इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी पुस्तकालय क्लोनों की एक बड़ी संख्या अत्यधिक घने स्थानिक व्यवस्था में फिट करने के लिए आवश्यक पैमाने के miniaturization के कारण. एक बार उत्पन्न, हम अगले दिखा दिया कैसे macroarray झिल्ली ब्याज की जांच लेबलिंग, झिल्ली संकरण, और संकेत का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का संशोधित संस्करण का उपयोग जीन के लिए जांच की जा सकती है. हम शामिल कदम की विस्तृत लिखित विवरण और आवश्यक सामग्री है, जो सभी के वीडियो उपलब्ध ऑनलाइन के साथ कर रहे हैं के साथ इन प्रक्रियाओं के दृश्य प्रदर्शन पूरित.
1. संकरण प्रक्रिया
एक संकरण ट्यूब 1 या 2 झिल्ली (22 सेमी द्वारा 22 आकार) ले जाएगा. संकरण मिश्रण के 50 मिलीलीटर और संकरण ट्यूब प्रति डीएनए जांच (10 एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता) के 0.5 मिलीग्राम का उपयोग करें. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, जेल - शुद्ध डीएनए जांच के रूप में उपयोग करें. यदि जांच तैयारी स्केलिंग अप, ट्यूबों की संख्या के बजाय ट्यूब प्रति अभिकर्मकों की राशि में वृद्धि की वृद्धि हुई है.
जांच तैयारी (0.5 मिलीग्राम डीएनए):
झिल्ली तैयारी और संकरण
2. जांच प्रक्रिया
वॉशिंग झिल्ली
सिग्नल पीढ़ी और पहचान (प्रक्रिया के लिए एक झिल्ली)
3. विपठ्ठन और प्रक्रिया भंडारण (NUF संस्करण)
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विपठ्ठन प्रक्रिया अनुकूलित नहीं किया गया है. हालांकि, विपठ्ठन निर्माता के अनुदेश (2 प्रत्येक washes, 100% इथेनॉल में 10 मिनट, 60 एसडीएस डिग्री सेल्सियस 0.5% में 1 1 ज धोने) में दी गई प्रक्रिया अपर्याप्त है. कम से कम 100% इथेनॉल में रात भर ऊष्मायन ECF प्रतिक्रिया उत्पाद भंग करने के लिए आवश्यक है, 100% इथेनॉल में कई दिनों के ऊष्मायन झिल्ली reprobe की क्षमता पर कोई प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है प्रकट होता है. निर्माता एसडीएस इलाज भी करने के लिए अपर्याप्त प्रतीत होता है. NUF 80 से कम 1 घंटे की कोशिश की है डिग्री सेल्सियस 0.5% एसडीएस पास उबलते सफलता के साथ 0.1% एसडीएस के साथ एक इलाज के द्वारा पीछा के साथ. ट्रेसी ने दिखाया है कि एक समय - उबलते के पास 0.1% एसडीएस के साथ - पर डालने के लिये पर्याप्त है.
सहायक संकेत:
संकरण बफर, संकरण ट्यूब, और प्राथमिक धोने बफर से 60 preheated होना चाहिए ° सी से पहले का उपयोग करने के लिए, और है कि तापमान में प्रयोग भर रखा जाना चाहिए. एक हीटिंग Corning थाली में 60 के बारे में 3 परिणामों की एक सेटिंग डिग्री सेल्सियस पर, उदाहरण के लिए, एक डूबे थर्मामीटर के साथ एक गर्म थाली पर बफ़र्स रखने
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| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur | |||
| Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685 | ||||
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ReplyPosted by: tilottamaMarch 14, 2010, 1:26 AM