Aislamiento de células madre de tejidos blandos musculoesqueléticos

En general, la completa modificación del procedimiento preplate requiere 1-2 días de preparación, una semana de realizar el procedimiento técnico, de 2-3 días de la identificación de células con inmunocitoquímica, y un adicional de 2-3 semanas de la expansión de la población de células madre. El equipo necesario para el cultivo de células madre es similar a la de otros sistemas de cultivo celular que incluye un sobremesa centrífuga, incubadora de CO _2, campana de flujo laminar de cultivo de tejidos y un microscopio invertido equipado con fluorescencia y una cámara digital. Las células madre aisladas también se pueden clonar y se pueden almacenar a largo plazo en nitrógeno líquido para el ^1,2 estudios actuales o futuros. Todos los reactivos y materiales utilizados para este procedimiento deben ser estériles y manipularse asépticamente.

Paso 1: Preparación

1. Colágeno capa placas de cultivo de tejidos y frascos: colágeno de tipo I derivado de piel de ternera (0,1 g en 1 litro, Sigma-Aldrich). Los recipientes de plástico para cubrir incluye: T-25 frascos, 6 o 12 pocillos, platos (60 y 100 mm, BD Falcon) como se describió anteriormente 1,2. Agite con cuidado el utensilios de plástico cada media hora, durante 4 horas para asegurar una capa de colágeno. La solución de colágeno se extrae. Y los utensilios de plástico recubierto luego se deja secar en la campana de cultivo de tejidos con la luz UV y el capó tanto, para asegurar la esterilidad y, finalmente, volver a tapar o cubrir para su uso posterior.
2. Preparar medio de cultivo celular: 400 ml DMEM (DMEM, la glucosa alta, Invitrogen), 50 ml inactivado por calor suero fetal bovino (FBS, Invitrogen), 50 ml de suero de caballo (HS, Invitrogen), y 5 ml de extracto de embrión del polluelo (CEE, precisa Chemical Co. ) se filtró al vacío con un disponible de 0,22 micras de 500 ml sistema de filtro estéril (Corning). Estéril a la penicilina / estreptomicina solución (Invitrogen) se añadirá finalmente de 100 unidades / ml. Las soluciones preparadas se pueden almacenar a 4 ° C durante al menos un mes. Esta solución se utiliza para separar las células del frasco cuando los cultivos de la división o la preparación de las células para el trasplante.
3. Calentamiento de soluciones para el aislamiento de células: Los siguientes reactivos deben ser calentado a 37 ° C antes de su uso para el aislamiento de células: buffer de Hank solución de sal (HBSS, Invitrogen), 0,2% (wt / vol) de colagenasa tipo XI (Sigma -Aldrich), con un promedio de 3.200 unidades de colágeno digestión por ml HBSS; Dispasa 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (wt / vol) de tripsina (Invitrogen).
4. Esterilizar el equipo quirúrgico en la preparación: Procedimiento quirúrgico estéril requieren instrumentos quirúrgicos, incluyendo: diferentes tamaños pinzas, tijeras micro, tijeras iris y / u hojas de bisturí. Además, el 15 y 50 ml tubos de centrífuga de polipropileno (BD Falcon); células colador (tamaño de poro 70 m) (BD Falcon), 18 -, 23 - y 27 agujas de calibre (BD PrecisionGlide) y 10 - o 20 ml- jeringas estériles (BD).

Paso 2: biopsias de tejidos, el aislamiento y la disociación mecánica ^4.1

Las biopsias de los tejidos se llevan a cabo bajo una campana de cultivo estéril e incluyen recién cosechado los tendones y los músculos esqueléticos se obtienen de la tibia o el sóleo músculos de la extremidad posterior de ratones de tipo salvaje (Mujer C57BL/6J, 4-5 semanas de edad o más joven Jackson, de laboratorio). Cualquier tejido visible conectivo, vasos sanguíneos y el tejido adiposo se elimina de las muestras de biopsia. Los tejidos de los tendones y los músculos son cuidadosamente identificadas bajo un microscopio de disección quirúrgica para eliminar los restos de piel y hueso y se coloca en un recipiente lleno de frío (4 ° C) HBSS (complementado con añadir un 5% de FBS). Los tejidos aislados luego se coloca en los platos por separado colágeno recubierto contiene HBSS frío y se procederá al picado (<1x1 mm ³⁾ en una pasta gruesa con micro-tijeras y / u hojas de bisturí.

Paso 3: La digestión enzimática de los tejidos:

El tejido picado luego disociadas enzimáticamente a través de una serie de pasos ^2,4,5

1. Transferencia de las suspensiones de tejido picado en distintos tubos de 15 ml y centrifugar a ~ 3500 rpm a 4 ° C durante 5 minutos.
2. Eliminar el sobrenadante, lavar con HBSS y repetir la centrifugación de nuevo.
3. Eliminar el sobrenadante, y digerir estos lodos mediante la adición de 10 ml de precalentado 0,2% de colagenasa tipo XI (Sigma). Incubar durante 60 minutos a 37 ° C, mientras que continuamente moviendo suavemente los tubos. Por otra parte, estrechar la mano cada 10 minutos.
4. Centrifugar y resuspender estos lodos en 10 ml dispasa (2,4 unidades / ml, Gibco) solución. Incubar durante 45 minutos a 37 ° C, agitando con las manos o mecerse suavemente cada 10 minutos.
5. Centrifugar y resuspender estos lodos en 10 ml de solución HBSS 0,2% de tripsina. De incubación puede variar en función de la medida en que las células solo se liberan de los tejidos que se pueden realizar mediante la observación de la suspensión bajo el microscopio. No se recomienda exceder de 30 minutos a 37 ° C, con inversión de los tubos o agitando suavemente cada 10 minutos.
6. Centrifugar la célula resultantes y vuelva a suspender el sedimento celular en 10 ml de la proliferación Medio (PM).
7. Disociar la suspensión de células al pasar el extracto a través de una serie de agujas. Las células se pasa dos veces a través de una 18G, 23G entonces, y, finalmente, una aguja 27G.
8. Pasar el extracto de células a través de un filtro de 70 micras de células.

Paso 4: Preplating para aislar diferentes poblaciones de células basadas en células tasa de ^3.1 adhesión

1. Centrifugar y resuspender los sedimentos celulares en medio de proliferación.
2. Placa de mezclas de la célula en un colágeno recubiertas frasco T-25 (o 60 mm plato) y se marca como PP1. La suspensión celular debe ser observada como poseedores de un gran número de núcleos de refracción y otros restos bajo el microscopio.
3. Se incuba a 37 ° C en un humidificado 5% incubadora de CO ₂ durante 2 horas.
4. La transferencia de células no adherentes a un nuevo colágeno recubiertas frasco T-25 (o 60 mm plato) y la marca es tan PP2. Añadir 5 ml de PM en la placa de la etiqueta PP1. Las primeras células que se unen a la adhesión del frasco son en su mayoría miofibroblastos ^3.
5. Retorno de los matraces a la incubadora durante 24 horas más, la transferencia de células no adherentes a un nuevo colágeno recubiertas frasco T-25 (o plato) y marcarlo como PP3. Añadir 5 ml de medio de proliferación en la placa de la etiqueta PP2. Estas células que se adhieren, que se adhieren a este frasco son en su mayoría fibroblastos ^2,3.
6. Volver frascos a la incubadora y repita el procedimiento en otras 24 horas hasta PP6 población se crea. Mantener a cada grupo de células en suspensión y permite que proliferen y examinar con regularidad utilizando un microscopio invertido. PP3-PP4 mioblastos son en su mayoría, mientras que las células musculares satélite a menudo se observa sobre todo en PP5 ^2.
7. La mayoría de las células poco a poco la adhesión típica, se adhieren al PP6. En esta etapa, las células parecen pequeñas, redondas de refracción, la luz y son muy escasos en número y son considerados como una célula madre 1,2 de la población.

Paso 5: Identificación y expansión de las células madre aisladas

1. El aislado PP6 células son muy pocos y deben ser mantenidos en los países ricos FBS medio de proliferación (20% de SFB en DMEM) que se cambia a diario. La mayoría de las células presentes en la matriz de la cultura PP6 durante las siguientes 1-2 semanas de cultivo, pero una gran y saludable PP6 población se crea normalmente después de un 1-2 semanas adicionales de expansión. Las células madre aisladas de los ratones altamente expresan el antígeno de células madre 1 (SCA1), CD34, hígado fetal kinasa 1 (Flk1), y otros marcadores ^1,2,6,7 madre que puede ser visualizado a través de tinción inmunocitoquímica. Estas células madre también presentan múltiples capacidades de diferenciación ^3,6,8.
2. Las células aisladas se mantienen y se expandió a una baja densidad celular en cultivo (de 12 y platos a 50-100 células / o confluencia <20-30% en el frasco o plato) para evitar la diferenciación de ^1,2. Muy pocas células forman los clones durante la expansión, y estas células madre clonadas pueden someterse a la proliferación de tiempo (LTP) en materia de estudios de otra competencia. Las células madre clonadas también se puede almacenar en nitrógeno líquido con los procedimientos generales de almacenamiento de células pe un PM con un 10% DMSO. Hacer una serie de poblaciones de paso bajo de las células madre de todos los estudios al otro hacia atrás.

Se ha reconocido que algunos tejidos adultos hay células madre múltiples. En los últimos años de estudio, las células madre se han detectado en los tejidos blandos musculoesqueléticos, incluyendo el músculo esquelético y el tendón. Este protocolo actual de los detalles de un procedimiento, conocido como la técnica preplate modificado, que ha sido utilizado con éxito en nuestro laboratorio para aislar las células madre adultas de los tendones y los músculos esqueléticos. Utilizando la técnica de preplate modificado descrito anteriormente las células se pueden dividir en varias poblaciones sobre la base de sus características de adhesión al colágeno recubiertas frascos (Figura 1). Fibroblastos y miofibroblastos encuentra dentro de los tejidos rápidamente se adhieren a los frascos de colágeno recubiertas plazo de 24-48 horas e inicialmente se separa de otras células en el PP1-PP2. Las células endoteliales miogénica o se adhieran a frascos de colágeno recubiertas después de un período de tiempo más largo, dentro de 48-96 horas (PP3-PP5), y puede ser cosechada e identificados por sus marcadores de superficie celular. Las células después preplated, 96 horas o más tarde (PP6), son consideradas como las células madre adultas (Figura 2). Las células preplate finales parecen pequeñas, redondas y translúcidas al comienzo de su aislamiento y se caracteriza además por citometría de flujo o inmunocitoquímica para la expresión de antígenos de células madre 1 (SCA1), CD34, hígado fetal kinasa 1 (Flk1), y otros marcadores de células madre (Figura 3). Las células madre aisladas tienen la capacidad de auto-renovación y estudios experimentales han demostrado su multipotencia a través de su diferenciación en las tres capas germinales: mesodermo, ectodermo, endodermo y ^9. Múltiples investigaciones han revelado que estas células madre se diferencian en células del linaje mesodermo incluyendo osteocitos, adipocitos, condrocitos y células hematopoyéticas ^6,8. Otros estudios han demostrado que las células madre adultas se diferencian en linajes de células ectodermo a través de su expresión de marcadores de las células neuronales y gliales y su capacidad para mejorar la función del miembro después de los nervios periféricos se ha dañado ^10. Estas células madre adultas aisladas han sido beneficiosas para la reparación de los tejidos musculoesqueléticos heridos y enfermos, y otros relacionados con los estudios in vivo se han realizado en otros tejidos, incluyendo el corazón, el hígado y la médula espinal, así como las condiciones médicas específicas como la submucosa de intestino delgado y la vejiga para el tratamiento de incontinencia urinaria de esfuerzo ^9.

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.