Isolare cellule staminali da tessuti molli muscoloscheletrici

In generale, la procedura completa preplate modificata richiede 1-2 giorni di preparazione, 1 settimana di eseguire la procedura tecnica, 2-3 giorni di identificazione delle cellule con immunocitochimica, e un ulteriore 2-3 settimane di espansione popolazione di cellule staminali. Le attrezzature necessarie per la cultura di cellule staminali sono simili a quello di altri sistemi di coltura cellulare che include un banco centrifuga, incubatore CO _2, il flusso laminare cappuccio tessuto cultura e di un microscopio invertito dotato di fluorescenza e una fotocamera digitale. Le cellule staminali isolate anche può essere clonato e possono essere conservati a lungo termine in azoto liquido per i ^1,2 attuali o futuri studi. Tutti i reagenti e materiali per la procedura deve essere sterile e trattati in modo asettico.

Fase 1: Preparazione

1. Collagene cappotto piatti colture di tessuti e fiaschi: collagene di tipo I derivato da pelle di vitello (0,1 g per 1 litro; Sigma-Aldrich). Il Plasticware per rivestire comprende: T-25 boccette, 6 o 12 piastre, piatti (60 e 100 mm, BD Falcon), come descritto prima di 1,2. Agitare delicatamente il Plasticware ogni mezz'ora, per 4 ore per garantire anche rivestimento del collagene. La soluzione di collagene viene quindi rimosso. E la Plasticware rivestito viene poi lasciato asciugare nel cofano di coltura con la luce UV e il cofano sia, per garantire la sterilità e, infine, richiuso o coperto per un uso successivo.
2. Preparare terreno di coltura cellulare: 400mL DMEM (DMEM, glicemia alta, Invitrogen), 50mL di calore inattivato siero fetale bovino (FBS, Invitrogen), 50mL Horse Serum (HS, Invitrogen), e 5 ml di estratto di Chick embrioni (CEE; accurata Chemical Co. ) sarà vuoto filtrata con un usa e getta 0,22-micron da 500 ml sistema di filtro sterile (Corning). Sterile penicillina / streptomicina soluzione (Invitrogen) saranno aggiunti infine 100 Unità / ml. Le soluzioni preparate può essere conservato a 4 ° C per almeno un mese. Questa soluzione è usata per staccare le cellule dal pallone quando culture scissione o la preparazione delle cellule per il trapianto.
3. Warm up soluzioni per l'isolamento delle cellule: I seguenti reagenti devono essere riscaldati a 37 ° C prima del loro utilizzo per l'isolamento delle cellule: soluzione salina tampone di Hank (HBSS, Invitrogen), 0,2% (peso / volume) collagenasi di tipo XI (Sigma -Aldrich), con una media di 3.200 unità di collagene digestione per mL HBSS; dispasi 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (peso / volume) tripsina (Invitrogen).
4. Sterilizzare strumenti chirurgici in preparazione: procedura chirurgica richiede sterili strumenti chirurgici, tra cui: diverse dimensioni pinze, micro-forbici, forbici iris e / o lame di bisturi. Inoltre, 15 e 50 mL provette in polipropilene (BD Falcon); filtro cella (diametro dei pori 70 m) (BD Falcon), 18 -, 23 - e 27-gauge aghi (BD PrecisionGlide), e 10 - o 20-ml siringhe sterili (BD).

Fase 2: biopsie dei tessuti, l'isolamento e dissociazione meccanica ^1-4

Le biopsie dei tessuti vengono eseguite sotto una cappa sterile e cultura sono appena raccolte e tendini dei muscoli scheletrici sono ottenuti dai muscoli soleo della tibia o della arti posteriori di topi wild-type (femmina C57BL/6J, 4-5 settimane di età o più giovani, Jackson di laboratorio). Qualsiasi tessuto connettivo visibile, vasi sanguigni e tessuto adiposo vengono poi rimossi dai campioni bioptici. I tessuti dei tendini e muscoli vengono poi accuratamente identificata al microscopio da dissezione chirurgica per rimuovere residui di pelle e ossa e posti in un piatto contenente freddo (4 ° C) HBSS (integrata con aggiungere il 5% di FBS). I tessuti isolati sono poi separatamente posti su piatti di collagene rivestito contenente HBSS freddo e sarà tritata (<1x1 mm ³⁾ in un impasto grossolano con micro-forbici e / o lame di bisturi.

Fase 3: la digestione enzimatica dei tessuti:

Il tessuto viene poi macinato dissociato enzimaticamente attraverso una serie di passi ^2,4,5

1. Trasferire il tessuto fanghi di macinazione in separata da 15 ml, tubi e centrifugare a ~ 3500 rpm a 4 ° C per 5 minuti.
2. Rimuovere il surnatante, lavare con HBSS e ripetere la centrifugazione di nuovo.
3. Rimuovere il surnatante, e digerire questi fanghi con l'aggiunta di 10 ml di preriscaldata 0,2% collagenasi di tipo XI (Sigma). Incubare per 60 minuti a 37 ° C, mentre continuo a dondolo delicatamente i tubi. In alternativa, agitare a mano ogni 10 min.
4. Centrifuga e risospendere questi fanghi in 10 ml dispasi (2,4 Unità / mL, Gibco) soluzione. Incubare per 45 minuti a 37 ° C, agitando dolcemente con le mani o dondolo ogni 10 min.
5. Centrifuga e risospendere questi fanghi in 10 ml di soluzione 0,2% HBSS tripsina. L'incubazione può variare in base alla misura in cui vengono rilasciate le singole cellule dai tessuti che possono essere eseguite osservando la sospensione al microscopio. Si sconsiglia di superare i 30 minuti a 37 ° C con invertendo i tubi o delicatamente a dondolo ogni 10 min.
6. Centrifugare la cellula con conseguentes e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di proliferazione Media (PM).
7. Dissociare la sospensione cellulare facendo passare l'estratto attraverso una serie di aghi. Le cellule sono poi passati 2 volte attraverso un 18G, poi un 23G e, infine, un ago 27G.
8. Passare l'estratto delle cellule attraverso un 70-micron filtro cellulare.

Fase 4: Preplating isolare diverse popolazioni cellulari basato sul tasso di adesione delle cellule ^1-3

1. Centrifuga e risospendere il pellet cellulare in media proliferazione.
2. Piastra di miscele la cellula su una collagene rivestito T-25 pallone (o 60 piatti mm) e contrassegnarlo come PP1. La sospensione cellulare dovrebbe essere osservato come in possesso di un gran numero di nuclei di rifrazione e altri detriti sotto il microscopio.
3. Incubare a 37 ° C in un umidificata, 5% CO ₂ incubatore per 2 ore.
4. Trasferire le cellule non aderenti ad un nuovo collagene rivestito T-25 pallone (o parabola di 60 mm) e marchio è come PP2. Aggiungere 5 ml di PM nella piastra etichettato PP1. Le cellule primi aderenti che attribuiscono al pallone sono per lo più miofibroblasti ^3.
5. Riportare la palloni per l'incubatore per altre 24 ore, il trasferimento di cellule non aderenti ad un nuovo collagene rivestito T-25 pallone (o un piatto) e segnare come PP3. Aggiungere 5 ml di Media proliferazione nella piastra etichettato PP2. Queste cellule aderenti che attribuiscono a questo fiasco sono prevalentemente fibroblasti ^2,3.
6. Ritorno di palloni l'incubatore e ripetere la procedura in un altro 24 ore fino a PP6 popolazione è creato. Mantenere ogni gruppo di cellule sospese e consentire loro di proliferare e di esaminare regolarmente utilizzando un microscopio invertito. PP3-PP4 sono per lo più mioblasti mentre le cellule satelliti muscolari sono spesso visti per lo più in PP5 ^2.
7. La maggior parte delle cellule lentamente aderendo tipicamente da allegare PP6. In questa fase, le cellule appaiono piccole, rotonde, rifrazione della luce e sono molto sparse in numero e sono considerati una cellula staminali 1,2 popolazione.

Fase 5: Identificazione ed espansione delle cellule staminali isolate

1. L'isolato PP6 cellule sono molto pochi e devono essere mantenuti in media FBS ricca proliferazione (20% FBS in DMEM) che viene cambiata ogni giorno. La maggior parte delle cellule presenti nello stampo PP6 cultura durante i successivi 1-2 settimane di coltura, ma una grande, sana PP6 popolazione è di solito creato dopo un ulteriore 1-2 settimane di espansione. Le cellule staminali isolate da topi altamente esprimere cellule staminali antigene 1 (SCA1), CD34, fegato fetale chinasi 1 (Flk1), e marcatori staminali altri ^1,2,6,7 che possono essere visualizzati tramite colorazione immunocitochimica. Queste cellule staminali mostrano anche le capacità di differenziazione più ^3,6,8.
2. Le cellule isolate sono mantenuti e ampliati a bassa densità cellulare in coltura (12-bene piatti a 50-100 cellule / pozzetto o confluenza <20-30% nel pallone o un piatto) per evitare ^1,2 differenziazione. Cellule molto pochi cloni forma durante l'espansione, e queste cellule staminali clonate possono subire proliferazione lungo tempo (LTP) per qualsiasi studio di competenza di altri. Le cellule staminali clonate possono anche essere conservare in azoto liquido mediante le procedure generali di conservazione delle cellule p.es. PM con il 10% di DMSO. Fare un numero di stock a basso passaggio delle cellule staminali per qualsiasi altro studio backup.

E 'stato riconosciuto che alcuni tessuti adulti contengono cellule staminali multiple. Nel corso degli ultimi anni di studio, le cellule staminali sono state rilevate nei tessuti molli muscoloscheletrici, tra tendine e muscolo scheletrico. Questo protocollo corrente dettagli una procedura, nota come la tecnica preplate modificata, che è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio di isolare le cellule staminali adulte da tendini e muscoli scheletrici. Utilizzando la tecnica sopra descritta preplate modificato le cellule possono essere divise in diverse popolazioni in base alle loro caratteristiche di adesione al collagene fiaschi rivestiti (Figura 1). Fibroblasti e miofibroblasti trovati all'interno dei tessuti rapidamente aderire al collagene fiaschi rivestiti entro 24-48 ore e sono inizialmente separate dalle altre cellule PP1-PP2. Le cellule endoteliali miogeniche o aderire a fiaschi collagene rivestito dopo un periodo di tempo più lungo, entro 48-96 ore (PP3-PP5), e può essere raccolto ed identificato marcatori cellulari di superficie. Le cellule poi PRONTI, 96 ore o più tardi (PP6), sono considerate cellule staminali adulte (Figura 2). Le cellule preplate tardo apparire piccolo, rotondo, e traslucido, all'inizio del loro isolamento e può essere ulteriormente caratterizzata mediante citometria di flusso o immunocitochimica per la loro espressione di antigeni di cellule staminali 1 (SCA1), CD34, fegato fetale chinasi 1 (Flk1), e altri marcatori di cellule staminali (Figura 3). Le cellule staminali isolate hanno la capacità di auto-rinnovamento e di studi sperimentali hanno dimostrato la loro multipotenza attraverso la loro differenziazione in tre foglietti embrionali: mesoderma, ectoderma e l'endoderma ^9. Molteplici indagini hanno anche rivelato che queste cellule staminali si differenziano in cellule della linea mesoderma compresi osteociti, adipociti, condrociti e cellule ematopoietiche ^6,8. Altri studi hanno dimostrato che le cellule staminali adulte di differenziarsi in linee cellulari ectoderma attraverso la loro espressione di marcatori di cellule neuronali e gliali e la loro capacità di migliorare la funzione degli arti dopo il nervo periferico è stato danneggiato ^10. Queste isolato cellule staminali adulte sono rivelati vantaggiosi per la riparazione dei tessuti muscoloscheletrici danneggiati e malati, nonché di altro tipo in studi in vivo sono stati condotti su altri tessuti tra cui cuore, fegato e midollo spinale così come le specifiche condizioni mediche come small sottomucosa intestinale e vescicale a trattare lo stress incontinenza urinaria ^9.

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.