Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

Commenti generali sul LCM di Drosophila periferiche neuroni

Lasciare da 6 ore, fino a una settimana o più per LCM a seconda del tipo di tessuto e il numero di cellule necessario.

Tutte le procedure vengono svolte in stretto RNasi-free seguenti condizioni procedure standard. Le larve che ha espresso 21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP o PPK-GAL4, UAS-mCD8:: GFP giornalista linee transgeniche sono state usate per questi esperimenti.

1. Preparare le larve

1. Raccogliere 30-40 pari età larve terzo instar e lavarli in DDH ₂ O seguito da risciacqui breve RNAse Away (Sigma-Aldrich), e un lavaggio finale in DDH ₂ O per rimuovere RNAse Away. Wick l'eccesso DDH ₂ O completamente con un Kimwipe pulito prima di incorporare le larve in ottobre
2. Prendere un pulito stampo embedding dei tessuti e lo strato con un sottile (1,5-2mm) strato di ottobre, appena sufficiente per coprire un singolo strato di larve.
3. Prima di incorporare le larve, se necessario, raffreddare il ottobre a 0 ° C in formelle del tessuto. A tale scopo, ponendo lo stampo contenente ottobre su un blocco di ghiaccio. Ciò contribuirà a ridurre il movimento delle larve durante il processo di incorporamento.
4. Posizionare le larve pulito sul pre-raffreddata ottobre e disporle in parallelo l'uno all'altro. Una volta che le larve sono state disposte, lentamente, riempire lo stampo con OCT senza disturbare la disposizione larvale. Snap congelare lo stampo ponendolo su un blocco di ghiaccio secco. [Punto Critico:. Snap-congelare le larve immediatamente per ridurre il movimento] Questo metodo permette alle larve di essere in un unico piano, massimizzando il numero di cellule disponibili per sezione per la cattura.

Se è necessario per preservare la morfologia dei tessuti per identificare le cellule di interesse, o se il numero previsto di cellule per sezione è risultato essere soddisfacente quindi procedere direttamente al passaggio 11.

In alternativa, se le cellule sono etichettati in modo specifico e può essere identificato con un marcatore facilmente identificabile come GFP o RFP, ma il numero di cellule per sezione si trova ad essere bassi, Piazza di Maggio 05-10 poi essere utile per aumentare il numero di cellule disponibili per l'acquisizione di ogni sezione. Si tratta di passi opzionali e devono essere considerati solo se necessario, come metodo per aumentare il numero di neuroni da LCM disponibili per ogni sezione quando l'altro metodo non riesce a fornire risultati favorevoli. [Attenzione: questo metodo possono turbare la morfologia generale del tessuto e rendono l'identificazione dei tessuti sulla base di specifici localizzazione spaziale molto difficile.]

5. Lavare 50-70 larve terzo instar come descritto al punto 1. Mettere le larve in un tubo da microcentrifuga 1,5 ml contenente 500 ml di RNasi libero PBS 1X.
6. Dounce le larve con un pestello in polipropilene (USA scientifico), con 6-7 colpi lenti potenti.
7. Centrifugare la soluzione a 16.000 (x) g per 5-10 secondi (fino a quando le cuticole larvali stabilirsi sul fondo della provetta da microcentrifuga]. Scartare il sopranatante. Il pellet deve essere principalmente costituito da cuticola larvale a cui il PNS, compresi i neuroni da , è strettamente aderito.
8. Lavare la cuticola pellet 2-3 volte in PBS 1X e risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS 1X. Spin la soluzione a 16.000 (x) g per 1 minuto a formare un compatto pellet. Aspirare il surnatante completamente con una multa pipetta Pasteur.
9. Rimuovere con attenzione il pellet dal tubo microcentrifuga con una spatola pulita e stoppino l'eccesso di PBS con un tessuto pulito Kimwipe. [Nota: è importante mantenere il pellet il più compatto possibile per aumentare il rendimento delle cellule]. Posizionare il compatto cuticola pellet su uno stampo di plastica contenente un sottile strato di ottobre (circa 1mm).
10. Allargare delicatamente il pellet in una zona sottile circolare. Riempire lo stampo con ottobre, e congelare i tessuti, come descritto al punto 4.
11. Utilizzando un criostato, tagliare sezioni congelate a 5-8 micron di spessore normale, etichettato, senza accusa, lastre di vetro libero microscopio RNAsi. [Fase critica: Posizionare le sezioni di tessuto vicino al centro della diapositiva.]
12. Conservare le diapositive direttamente su ghiaccio secco o a -80 ° C in un ambiente pulito slide-box fino al momento microdissezione. LCM eseguire preferibilmente entro una settimana dopo il sezionamento dei tessuti.

PAUSA PUNTO

2. Rimozione disidratazione e cuticola da congelati sezioni larvali

[Punto Critico: Tutte le soluzioni per la disidratazione deve essere preparato fresco prima di ogni sessione LCM. Disidratazione completa di sezioni di tessuto congelato larvale è essenziale per raggiungere l'efficienza ottimale microdissezione]

1. Rimuovere i vetrini contenenti le sezioni congelate di tessuto larvale dal freezer ° -80 C e disporli sul ghiaccio secco.
2. Rimuovere una singola diapositiva da ghiaccio secco e subito posto direttamentein una provetta da 50 ml conica riempita con fissativo etanolo al 70%, seguito da un breve risciacquo in RNasi libero DDH ₂ O secondo i tempi indicati nella tabella 1.
3. La presenza della cuticola larvale nelle sezioni congelate può compromettere l'efficienza di cattura, impedendo efficiente LCM cap-cellula contatto che può portare a non specifici di cattura. Se necessario, effettuare le seguenti operazioni (4-5) per eliminare la cuticola da sezioni di tessuto.
4. Delicatamente pipetta 50 ml di 2,5% tripsina direttamente sul sezioni di tessuto e incubare per 5-30 secondi a temperatura ambiente. [Punto Critico: Questa fase può richiedere di ottimizzazione. Il tempo di incubazione dipende dal tessuto da microdissezionate e lo spessore della sezione. Più lungo di incubazione può cancellare tutto comprese le cellule di interesse, mentre una breve incubazione può essere insufficiente a rimuovere la cuticola]
5. Sciacquare le sezioni brevemente in un tubo da 50 ml conica contenente RNasi-free DDH ₂ O per rimuovere tripsina, e frammenti di cuticola liberamente aderito.
6. Immergere i vetrini in sequenza in ciascuno dei rimanenti etanolo e xilene soluzioni per i tempi consigliati (Tabella 1) per completare il processo di disidratazione.
7. Seguendo il gradiente di disidratazione, le diapositive sono brevemente secco sotto flusso di aria mite per 60-120 secondi a temperatura ambiente prima di eseguire LCM. [Attenzione: Secco lo xilene completamente dalle sezioni di tessuto prima di eseguire LCM. Lo xilene è noto per sciogliere la calotta LCM polimero con conseguente fallimento microdissezione].

Tabella 1: procedura raccomandata per la disidratazione LCM di sezioni di tessuto congelato larvale.

3. Laser Capture Microdissezione

PixCell IIe strumento LCM dotato di Fluor 300 epifluorescenza ottica ottimizzata per EGFP è stato utilizzato per eseguire il LCM.

[Fase critica: se possibile, effettuare la microdissezione in una umidità controllata spazio per evitare una riduzione in termini di efficienza microdissezione a causa di un aumento dell'umidità. L'umidità della stanza è un fattore critico influenzano l'efficienza microdissezione. Camera bassa umidità può causare un aumento statico-si aggrappano con conseguente non specifici cattura, mentre la camera alta umidità può provocare in termini di efficienza microdissezione bassa. Abbiamo raggiunto la massima efficienza LCM tra il 25-50% di umidità relativa.]

1. Accendere il microscopio e per il controllo casella di laser.
2. Caricare il tappo di montaggio CapSure titolare con HS LCM tappi (Molecular Devices): Due cartucce di tappi LCM possono essere caricati in una sola volta.
3. Aprire il software Molecular Devices e inserire i dettagli dell'esperimento, comprese numero di diapositiva e numero di lotto Cap.
4. Caricare una nuova HS tappo LCM dalla cartuccia sullo strumento PixCell IIe LCM e posizionarlo correttamente con riguardo al joystick per garantire il corretto posizionamento del tappo in relazione alla zona di cattura.
5. Posizionare il vetrino contenente appena disidratato sezioni di tessuto larvale sul palco microscopio per microdissezione.
6. Individuare le cellule marcate utilizzando il oculari o lo schermo del computer. A causa della elevata specificità di PPK-GAL4, UAS-mCD8:: GFP linea giornalista transgenico, la classe IV da neuroni possono essere facilmente identificati da GFP fluorescenza.
7. Oggetto del tessuto di LCM con CapSure HS LCM tappi [per una serie dettagliata di istruzioni per la configurazione dello strumento, focalizzando il laser e l'esecuzione di LCM vedi riferimento ^22].
8. Regolare il "Power" e "Durata" i parametri degli impulsi laser per ottenere un punto preciso polimero fuso, le cui dimensioni corrispondono alle dimensioni selezionate spot laser. Regolare le impostazioni per personalizzare le dimensioni del polimero fuso zona. I seguenti parametri sono stati usati per microdissecting singola classe IV da neuroni: diametro spot 7,5 micron, la resistenza laser 30-50 mW, il tempo di laser e 2-4 e 1-2 ms scotta per cella sono stati utilizzati. [Fase critica: i parametri laser necessari per un posto giusto può variare con lo spessore del tessuto e le condizioni di umidità ambiente. Regolare il "Power" e "Durata" le impostazioni per ottenere la necessaria dimensione del punto polimero fuso per microdissecting cellule singole o multiple.]
9. Per massimizzare la specificità, microdissect cellule con sovrapposizione minima e una forte fluorescenza. Ogni cuffia è in grado di catturare numerosi corpi cellulari. [Fase critica: per evitare la degradazione dell'RNA, limitare il tempo totale di analisi tra cui la disidratazione e microdissezione a meno di 45 minuti]
10. Una volta che tutte le cellule di interesse sono stati catturati, sollevare il coperchio HS LCM con le cellule microdissezionate e lo mise su un vetrino pulito per confermare la presenza delle cellule catturato e ispezionare visivamente il tappo per la presenza di cellule indesiderate o detriti.

4. Isolamento dell'RNA da LCM cellule derivate

1. Fissare il tappo che contiene le cellule microdissezionate ad un ExtracSure (Molecular Devices) del dispositivo. Aggiungere 12μl di RNA tampone (PicoPure, Molecular Devices) per la superficie del cappello che contiene le cellule e collegare un invertito a parete sottile tubo di reazione (GeneAmp, Applied Biosystems) al dispositivo ExtracSure. Posizionare il gruppo su un vassoio di allineamento (Molecular Devices) e coprire con un blocco di incubazione (Molecular Devices) pre-riscaldato a 42 ° C all'interno di un incubatore.
2. A seguito di una incubazione di 30 minuti, centrifugare le provette contenenti gli estratti a 800 (x) g per 2 minuti. Chiudere i tubi e conservare il estratti cellulari a -80 ° C fino al momento per la purificazione di RNA.

PAUSA PUNTO

3. Estrarre e purificare l'RNA colonna in base alla PicoPure (Molecular Devices) Istruzioni kit di estrazione di RNA. DNAsi trattamento è facoltativo, e può essere eseguita su colonna durante la purificazione dell'RNA, se necessario. Se necessario, i campioni di LCM multiple possono essere raggruppate durante la purificazione in una sola colonna per aumentare la resa finale di RNA e può essere eluiti in un piccolo volume (11-30 mL) di tampone di eluizione (PicoPure, Molecular Devices) e conservati a -80 ° C fino al momento dell'utilizzo. Se lo si desidera un 1 microlitri aliquota può essere utilizzato per valutare la qualità totale RNA su un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.).

Rappresentante Risultati

Microdissezione laser capture (LCM) è stato utilizzato per isolare singole, specifiche della classe o più neuroni da Drosophila dalla terza larve instar (Figura 1). LCM consente un elevato grado di precisione e specificità nell'isolamento della Drosophila da corpi cellulari dei neuroni (Figura 2a-c). Inoltre, l'RNA totale purificato da questi neuroni isolati da è risultata essere di ottima qualità, come indicato dalla presenza di forte 5.8S, 18S e 28S picchi di RNA ribosomiale se analizzato su un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) (Figura 2d).

Per valutare l'neuronali specifici per l'arricchimento delle nostre cellule isolate abbiamo eseguito in tempo reale quantitativo PCR di trascrizione inversa (QRT-PCR) utilizzando il neuronale gene specifico marcatore, ELAV. Per la qRT-PCR analisi, abbiamo calcolato i livelli relativi di espressione ELAV nel LCM microdissezionate neuroni e normalizzato da questa espressione a quella del nostro controllo endogeno (rp49) e relativi a RNA totale isolato da larve di tutto con il metodo ΔΔCt ^23. Queste analisi hanno rivelato l'arricchimento oltre 2,5 volte nei livelli relativi di ELAV in LCM micro-sezionato da campioni neurone rispetto agli animali interi (Figura 3).

Figura 1: LCM di Drosophila neuroni periferici. (A) Età abbinati larve terzo instar vengono selezionate, lavate e (b) incorporato in un cryomold con OCT e congelati a -80 ° C, (c) 8μm sezioni di tessuto di serie sono creati usando un criostato standard e (d) sono collocati in modo uniforme su lastre di vetro pulito. I vetrini con le sezioni di tessuto apposto sono conservati a -80 ° C prima di LCM di elaborazione. (E, f) che precede immediatamente LCM, le sezioni di tessuto sono scongelati e brevemente fissato in etanolo al 70% seguita da risciacquo breve DDH ₂ O. (g) Le diapositive sono brevemente incubati con tripsina e risciacquati con DDH ₂ O per rimuovere le cuticole (nero) dalle sezioni larvale. (h, i) sezioni di tessuto senza cuticola larvale sono poi ulteriormente disidratato in un gradiente di etanolo e, infine, eliminato in xilene . (j) Il tappo LCM con un polimero termolabili è posto sulla sezione di tessuto e il laser pulsato è sul corpo selezionato cellule fluorescenti. L'impulso laser si scioglie il polimero e avvolge il corpo selezionato di celle. Il tappo polimero, insieme al corpo cellulare catturato viene sollevato, e (k)

Figura 2: LCM facilita la cattura di alta precisione di neuroni da. (A) l'immagine di un rappresentante disidratati e tripsina trattati 8 micron sezione di tessuto prima di LCM spettacolo, che mostra due classi IV neuroni da etichettati con GFP dal PPK-GAL4, UASmCD8:: ceppo giornalista GFP. Nota, uno dei neuroni è evidenziato (punta di freccia) per l'acquisizione. (B) corpo cellulare del neurone evidenziato (freccia) è pulito micro-sezionato con elevata specificità dalla sezione di tessuto. (C) End-on vista di una sola classe -IV da neurone catturato sul tappo LCM. (d) Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) elettroferogramma di RNA totale isolato da LCM neuroni derivati ​​da, mostrando ottime qualità dell'RNA, come indicato dalla presenza di 5.8S taglienti, 18S , e picchi di rRNA 28S.

Figura 3:. QRT-PCR rivela arricchimento sostanziale di espressione neuronale gene marcatore in LCM catturato da neuroni rispetto alla intero animale qRT-PCR analisi di neuroni specifici per l'espressione del gene marcatore (ELAV) in LCM catturato da neuroni (21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP) e animali interi in età corrispondente larve terzo instar è stata eseguita in triplice copia. Livelli relativi di espressione ELAV in LCM catturati da neuroni sono stati normalizzati al controllo endogeno (rp49) e relativi alle larve tutto con il metodo ΔΔCt ^23. Un arricchimento 2,5 volte nei livelli relativi di ELAV in LCM catturato da campioni neurone è stato osservato rispetto ai animali interi.

Risoluzione dei problemi

Problema: degrado, o di bassa qualità RNA.

Garantire condizioni di libera RNAse tutto esperimento. Provare a ridurre quantità di tempo speso per LCM per diapositiva a 30 minuti. Tenere le diapositive e campioni in ghiaccio secco, tranne quando si eseguono LCM. Evitare di scongelare le sezioni di tessuto, una volta che vengono tagliati.

Problema: La maggior parte delle cellule sono persi dalla diapositiva durante il trattamento con tripsina (passo 17-18).

Provare a ridurre il tempo di trattamento tripsina. Provare a ridurre la concentrazione di tripsina.

Problema: Presenza di cuticola e altri non specifici frammenti di tessuto sul polimero cap.

Prova a rimuovere i frammenti di tessuto tamponando la superficie polimerica con il lato cattivo gusto di una nota adesiva ^22.

Problema: bassa efficienza LCM.

Prova ad aumentare il tempo di incubazione in 100% di etanolo e xilene. Ridurre l'umidità ambiente utilizzando deumidificatori.

Il protocollo presentato nel presente documento descrive il nostro metodo ottimizzato per l'isolamento dei neuroni Drosophila periferiche mediante LCM. Anche se questo protocollo LCM è stato progettato per l'isolamento specifico di singole, specifiche della classe o più neuroni da Drosophila dal terzo stadio larvale instar di sviluppo, piccole modifiche del protocollo può essere facilmente adattato per la cattura di altri tipi di cellule di Drosophila da ogni sviluppo fasi distinte utilizzando GAL4, UAS-mCD8-GFP transgeni giornalista che l'etichetta del tipo di cellula o tipi di interesse. I nostri risultati dimostrano che l'RNA ottenuto dalla cattura laser micro-sezionato da neuroni è di qualità molto elevata che consente per un potenziale uso diretto in qRT-PCR o microarray a base di analisi. Le applicazioni di questo protocollo si estendono oltre la cattura di wild-type cellule di interesse, come discusso qui, dove LCM potrebbe essere utilizzato in combinazione con la perdita di funzione (UAS-RNAi) e / o il guadagno di funzione studi che impiegano il GAL4 / SUP sistema in un tipo di cellula di interesse.