Микродиссекции данио рерио эмбриональных тканей глаз

Часть 1: Подготовка перед микродиссекции

1. Решения
   1. E3 среду ⁴ (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl ₂ и 0,33 мМ MgSO _4).
   2. Раствор Рингера ^{1, 5} (116 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl _2, 5 мМ HEPES, pH7.2), фильтр стерилизовать.
   3. 5N NaOH.
2. Химическое травление вольфрамовой иглы
   1. Безопасные небольшой химический стакан, содержащий 5N NaOH на чашку Петри на глине.
   2. Прикрепить скрепку на стороне стакана, так что он вступает в контакт с раствором NaOH.
   3. Подключите отрицательный электрод от источника питания постоянного тока на скрепку и положительного электрода к одному концу короткая часть (~ 2 см) из вольфрамовой проволоки.
   4. Оберните другой конец вольфрамовой проволоки с небольшим шариковый пластилин и падения этой целью в раствор NaOH.
   5. Повышение напряжения до примерно 3 В и падение проволоки вверх и вниз в раствор NaOH до хорошую скорость травления достигается. Иглу в хорошем качестве можно обычно запечатлелись в 10 минут.
   6. Вольфрамовой проволоки подвергаются решение будет постепенно стали тоньше. Когда мяч глины падает, с другой стороны провода, который все еще присоединен к положительному электроду будет резкое форму иглы.
   7. Промыть острой иглой с раствором Рингера или E3, чтобы удалить отложения солей.
   8. Прикрепить иглы аппликатора деревянные лентой или иглодержателя для легкой обработки.
3. Культура пластин
   1. Сокол 60 х 15 мм пластинах полистирола культуры готовы использовать для сетчатки микродиссекции.
   2. Для вскрытия РПЭ-прилагается сетчатки, раздавить двух эмбрионов полностью в культуру пластину, содержащую раствор Рингера, чтобы избавиться от клейкости поверхности за 30 минут до вскрытия. Незадолго до вскрытия, вымыть пластины широко раствором свежего Рингера.
4. Эмбрионы сбора и постановки
   1. Взрослых рыбок данио ведутся, как описано ^{4, 5.}
   2. Отдельные родители рыбы в стационарных цистерн разведения попарно делителя ночь перед размножением.
   3. Удалить разделитель после комнате свет включен в следующее утро. Разрешить родителям крест на 10-минутным интервалом каждые полчаса. Отдельные рыбы после каждого перехода.
   4. Поддерживать эмбрионами собрали с каждого пересечения в E3 среду отдельно при 28 ° C.
   5. Этап эмбрионов на 10 до 12 часов после оплодотворения (HPF) и restage непосредственно перед рассечение на конкретные моменты времени, в соответствии с установленными критериями ^{1, 6.}

Часть 2: Dissection - удаление мозга и глаз выдержка ¹

• Процедуры, описанные в этом разделе, являются общими для вскрытия сетчатки (Часть 3А) и РПЭ-прилагается сетчатки (Часть 3B).
• Все прекрасно вскрытия осуществляются при помощи кончика Дюмон щипцов и помогать другой паре Дюмон щипцы для позиционирования ткани. Химическим травлением вольфрамовой иглы могут использоваться для тонкой манипуляции, если необходимо.
• Все прекрасно вскрытия проводятся на ~ 5-8-кратным увеличением при Olympus SZX16 микроскоп с 1X цель или эквивалент.
• Поддерживать эмбрионами в E3 среды в настольный инкубатор при 28 ° C рядом с микроскопом для легкого доступа эмбриона во время вскрытия.
• Столике микроскопа нагревают до 28 ° С пластиной термо чтобы свести к минимуму влияние колебаний температуры на экспрессию генов.

1. Передача эмбриона на конкретной стадии развития, чтобы раствор Рингера в Сокол 60 X 15 мм пластины культуры получали, как описано в части 1 # 3.
2. Отрезанная голова с частью передней ствол быстро из организма.
3. Pin заднем конце этой ткани на культуру пластину с помощи щипцов.
4. Открытая головка на спинной стороне, начиная с переднего лоб.
5. Удалить мозга так, чтобы медиальной стороны глаз подвергается и вверх для дальнейших манипуляций.

Часть 3А: вскрытие сетчатки ¹

1. Подготовка эмбрионов, как описано в Части 2.
2. Тщательно кисти подвергается ПЭС на медиальной стороне глазного яблока, который сталкивается в сторону повышения на кончике пинцета, пока небольшое отверстие в сетчатке видел.
3. Продолжить чистки и пилинга действия до медиальной стороны сетчатки почти все выступающие. Избегайте царапин и штамповки подвергаются сетчатки.
4. Для удаления боковых ПЭС на сетчатке, которая в настоящее время сталкивается вниз, подход, который и кисть под углом примерно 45 ° от поверхности пластины культуры.
5. Удалить НПП, который прилагается довольно твердо ора Серрата, закрепив отдельные части НПП, чтобы сulture пластина для вскрытия, а затем поднимите сетчатки мягко.
6. Ролл сетчатки на дне культуры блюдо для очистки остаточных ППД.
   1. Мы заметили, что этот конкретный полистирола Сокол культуры пластина имеет преимущественное соблюдение НПП в течение приблизительно 20 минут один эмбрион подавлено. Это свойство используется для удаления остатков РПЭ. Тем не менее, клетки сетчатки сделать прилипают к поверхности, в меньшей степени, которые могут быть проверены тесно при большом увеличении. Нужно найти баланс между полнотой НПП удаления и сетчатки целостности.
   2. Линзы часто придерживается культуры пластины и отделяется от сетчатки в процессе прокатки. Иногда, необходимо отделить объектив травления иглы вольфрама с закрученной действие на поверхности линзы.
7. Эти процедуры могут успешно удалить НПП от сетчатки без ущерба для целостности тканей. На это указывает хорошее общее морфологии (рис 1B и B ') и гистологии (рис. 1В "), стрелка, в частности, сохранение внеклеточного матрикса между слоем фоторецепторов и РПЭ является исключительно хорошим (рис. 1В."; сравнить с гистологии со всего эмбриона (рис. 1А ")).

Часть 3B: НПП подключением сетчатки рассечение ³

1. Подготовка эмбрионов, как описано в Части 2.
2. Pin головы до культуры пластины ассистент пинцетом. Поднимите глаза мягко от задней боковой-н-ролл на передней стороне.
   1. Предполагаемого сосудистой оболочки и склеры ткани на внешней стороне слоя НПП крепятся довольно плотно к коже и может быть главным образом снимают прокаткой глаза внимательно передней стороне.
3. Снимите объектив с вольфрамовой иглы после боковой стороне глаз подвергается и тогда, когда глаз еще привязаны к коже.
4. Эти процедуры могут успешно сохранить целый пласт РПЭ с сетчаткой. Фиксированные choroids и склеры ткань может быть в значительной степени удалено (рис. 1С, С и С ").

Часть 4: образец ткани коллекции для работы РНК

1. Расчлененный образцы могут быть собраны в TRIzol в РНКазы без микроцентрифужную трубки для определения характеристик вниз по течению РНК, как описано выше ^1.

Представитель Результаты

Рисунок 1. () Боковые и (') спинной зрения данио личиночной головы на 52 HPF до вскрытия. (") Соответствующей гистологической части личиночной головы () & ('). (В) и бокового (В') спинной зрения расчлененные сетчатки на 54 HPF. Поверхности сетчатки цел с обеих боковых и спинной взглядов. (В ") соответствующей гистологической части расчлененного сетчатки (B) и (В '). Структура сетчатки и сетчатки ламинирования был цел. В частности, внеклеточного матрикса между слоем фоторецепторов и НПП (", стрелки) хорошо сохранился в расчлененный сетчатки (В", стрелки). (C) Боковые и (С) медиальные зрения расчлененные РПЭ-прилагается сетчатки на 52 HPF. НПП слой цел и непрерывным, который также обозначается гистологической части расчлененного ткани (C "). Белую область в С" является зрительного нерва (стрелка). Для гистологии, образцы тканей были собраны и зафиксированы в 4% параформальдегида. Пластиковые вложения и секционирования этих образцов были выполнены, как описано ^3. Шкала бар = 50 мкм.

Микродиссекция тканей данио глаз может эффективно получить нетронутыми сетчатки и РПЭ-прилагается сетчатки. Это существенно помогает выражение исследований, касающихся конкретных тканей глаза (например, сетчатки или РПЭ). На самом деле, мы успешно использовал эти процедуры, чтобы получить профили РНК выражение целого сетчатки ¹ и НПП ^3. Полезность этих профилей активно поддерживают наше недавнее определение путей и семейств генов, которые в возмущенной сетчатки дифференциации мутантов ^2. Наиболее важных шагов в сетчатке процедуры расчленения чистки действия кончике пинцета и тканях прокатки для НПП удаления остатков. Мы находим положив локти на регулируемые подлокотники в кресле во время вскрытия, могут существенно стабилизировать нежелательных движений руки. Кроме того, некоторые НПП остатки могут оставаться в ора Серрата. Это потому, что этот регион не может вступать в контакт с соблюдением поверхности культуры пластина для вскрытия. Тем не менее, большинство клетки ПЭС нарушаются во время акции чистки и пилинга и эти остатки НПП вряд ли будут неизменными. Кроме того, баланс должен быть баланс между сетчатки целостности и полноты НПП удаления. Для вскрытия РПЭ-прилагается сетчатки, большинство из предполагаемого сосудистой оболочки и склеры тканей, которые выглядят как тонкая прозрачная мембрана, может быть снимают вместе с кожей. Кроме того, можно удалить эти остатки щеткой поверхности ткани, однако баланс должен быть баланс между РПЭ целостности и полноты загрязняющих ткань удаления. Мы успешно выполняется рассечение от 1-3 DPF (24-72 HPF), которые охватывают критических этапах данио глаз морфогенеза ^7. В среднем это займет приблизительно от 10 до 20 минут от головы к разрыву коллекция расчлененный тканей. С практикой, студент может выполнить хороший и последовательный рассечение в течение одного месяца.