The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Environmental Microfluidics Group, MIT - Massachusetts Institute of Technology
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 50.19.155.235, User IP: 50.19.155.235, User IP Hex: 840145899
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Seymour, J. R., Marcos, Stocker, R. Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers. J. Vis. Exp. (4), e203, doi:10.3791/203 (2007).
Hazırlık
1. Mask oluşturun
Bir CAD yazılımı kullanarak, yüksek çözünürlüklü bir şeffaflık baskı için kanal tasarımı. Bu, "maske" olacaktır.
Temiz oda:
2. Gofret temizleyin ve fırında
İlk, Aseton ile fışkırtma gofret, sonra hızla Metanol ile, daha sonra Isopropanol. Son olarak, gofret Azot kullanarak kurutun.
5 dakika fırında (130 ° C) gofret pişirin.
3. Kaplama gofret
Spin-kaplama makinesi merkezinde gofret yerleştirin. Şişe gofret üzerine dökün fotorezist (SU-8). SU-8 akım edelim ve ~ 10 saniye süreyle dinlenin Spin-lak açın ve 0 ile 5 sn içinde 500 rpm hız rampası, 10 s için 500 rpm'de 10 sn içinde son hıza kadar rampa ve son hızda korumak için 30 saniye Son hızı kullanılan hedeflenen kaplama kalınlığı ve SU-8 bağlıdır. Ayrıntılar bulunabilir http://www.microchem.com/
4. Yumuşak bake
Gofret kaplama sonra, 65 ° C ve daha sonra 95 ilk fırında ° C Pişirme süresi, kullanılan paslanmaz çeliğin hedeflenen kalınlık ve türüne göre değişir. Sonra, gofret, en az 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
5. Maruz kalma
Maske gofret üstüne yerleştirin ve SU-8 kılavuzunda önerilen süre için UV ışığı gofret maruz.
6. Post-maruz kalma fırında
Gofret pişirin 65 ° C ve daha sonra 95 ° C SU-8 manuel talimatları izleyerek.
7. Gofret Gelişmekte olan "master" (küf) elde etmek için
Geliştirici (PMMA) ile dolu bir beher hazırlayın. Fotorezist Pozlanmamış parçası yıkanıp kadar çok nazikçe beher salınan behere gofret bırakın.
Laboratuarımızda:
8. PDMS hazırlayın ve gofret üzerine dökün
Bir kap içine 10:1 oranını PDMS sertleştirici ile karıştırın. Karıştırın ve homojen bir karışımı: Bu baloncuklar çok üretmek ve karışımı opak bir görünüm yapacak. "Ana" karışımı dökün.
9 - De-bubble vakum odasına
Kabarcıklarını çıkarmak için, bir vakum odasına kadar tüm kabarcıklar gitti kapsayan master ve PDMS karışımı yerleştirilir.
10 Fırın Pişirme
En az 12 saat, 65 ° C sertleşmesine PDMS fırında pişirin .
11. Delgeç
Kanalların giriş ve çıkışları için ana ve zımba delikleri PDMS soyun.
Temiz (gösterilmemiştir)
12. Plazma bağlar
Kanallar PDMS katman ve 1 dakika boyunca oksijen plazma ile cam slayt hem de tedavi sonrası bir bardak slayt yapıştırılır.
Deneyleri:
Uzm # 1: mikro ölçekli besin katmanları deniz mikropların kemotaktik yanıt incelenmesi
1) deneme ayarlama
2) deney Koşu
Uzm # 2: bir vortexZ yüzme deniz bakteriler üzerinde kayma etkileri araştırılması
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Deniz mikropların kendi yerel kimyasal ve fiziksel çevre ile etkileşim nasıl bir anlayış, okyanusların besin ve karbon döngüsü (Azam ve Malfatti 2007) planktonik mikroorganizma rolü daha tam ve kesin bir algı için zorunludur. Ancak, birçok önemli mikrobiyal etkileşimleri üzerinde küçük ölçeklerde (mm) nedeniyle, teknik sınırlamalar heterojen biyo-fiziko-kimyasal bir manzara içinde mikrobiyal davranışı ayrıntılı muayene engellemiştir okyanus yüzme mikropların yaşadığı tahmin. Mikroakiskan son gelişmeler (Whitesides ve ark 2001), mikrobiyal ekoloji karmaşık microhabitats içinde detaylı analizler etkin (Mao ve ark 2003, Park ve ark 2003, Keymer ve ark 2006, Marcos ve Stocker 2006). Mikroakışkan cihazlar tek bir hücre düzeyinde (Blackburn ve ark 1997, 1998) bize bir difüzyon besin yama deniz mikropların hem kemotaktik yanıt incelemek için izin burada açıklanan ve çalkantılı kesme içinde mikropların yüzme davranışı.
Mikroakışkan kanalları yapımında yer yumuşak litografik üretim süreci, kanallar içinde akar ve degradeleri hassas kontrolüne izin veren kanal mimarisi içinde oluşturulacak karmaşık detayları için sağlar. Karşılaştırmalı çalışmalar için oluşturulan çeşitli ölçüler kanalları için üretim tekniği ile sağladığı esneklik sağlar. Görüntü analiz sistemi, burada tek tek hücrelerin ve besin gradyanlar görselleştirme mikrobiyal yüzme ve kemotaktik davranış ayrıntılı kantitatif analiz için bir platform sağlayan tek hücreli ve nüfus seviyesi, izin uygulanır.
Biz bu mikroakışkan kanal yüzme deniz mikropların çeşitli hassas bir kemotaksis assay olarak uygulanan ve birçok türün yama içinde yüksek besin konsantrasyonu içinde hücre yoğun kümeler oluşturan, hızla bir besin difüzyon yama cevap verme kapasitesine sahip olduğunu bulduk. Kemotaktik besin yama içinde hücreler birikimine sırasında, bazı türler de hız yüzme ve frekans dönüm değişiklikler de dahil olmak üzere davranışsal vardiya, işaretlenir sergiledik. Bizim gözlemler, önemli bir büyüme habitatlar olarak okyanus deniz mikroplar kısa ömürlü besin yamaları kullanabileceği anlamına hipotezini deneysel destek sağlar.
Farklı kanal geometrisi kullanarak, su ortamında mikrobiyal dinamikleri ile ilgili ölçeklerde istikrarlı microvortices üretebilir. Bu kurulum, bize farklı kesme oranları yanıt yüzme bakterilerin davranışlarını gözlemlemek için izin verir. Latent akım koşul altında rasgele yüzme davranışı tersine, güçlü bir kayma etkisi altında, bakteri hem de takip akış alanının düzenler ve onlarla uyumlu. Bu kurulum, mikroorganizmalar ve onların sıvı dinamik çevre arasındaki temel etkileşim değerli bilgiler sunmaktadır.
Bu deneylerin her birinde, Mikroakiskan mikrobiyal davranışı dinamik microhabitats içinde eğitim için etkili bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Mikrobiyal dinamiklerinin doğal habitatları ve mikroakışkan teknolojinin yeni uygulamaları içinde önemi giderek artan bir tanıma, biz mikrobiyal ekoloji ile Mikroakiskan daha kaplin önemli yeni anlayışlar verecektir öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
MIT'de Microsystems Teknoloji Laboratuvarları Biz temiz oda tesisi bu video filmi parçası için bize izin verdiği için teşekkür etmek istiyorum.
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
1. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology 5, 782-791 (2007).
2. Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography 42, 613-622 (1997)
3. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J.G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science 282, 2254-2256 (1998)
4. Keymer, J.E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R.H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science 103, 17290-17295 (2006)
5. Mao, H., Cremer, P.S., Manson, M.D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science 100, 5449-5454 (2003)
6. Marcos, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods 4, 392-398 (2006)
7. Park, S., Wolanin, P.M., Yuzbahyan, E.A., Lin, H., Darnton, N.C., Stock, J.B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences 100, 13910-13915 (2003)
8. Whitesides, G.M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D.E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering 3, 335-373 (2001)
Dear Justin,
Thank you (and Marcos) for the very instructive video; the part on PDMS production is very instructive and the scientific work is very interesting. When the work is published, I would like to know, so I can take a look.
I do have an experimental question on your chemotactic experiments. In these expriments, you use a fluorescene dye to visualise the nutrient diffsuion. I am wondering what dye you used for visualisation, as most dyes are bulky molecules that have substantially lower diffusion coefficients than the (rather small) ammonia molecule. Thanks for the information.
Dirk Renckens
2
ReplyPosted by: AnonymousApril 15, 2008, 4:38 AM