PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

Hafner, M., Landthaler, M., Burger, L., Khorshid, M., Hausser, J., Berninger, P., et al. PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins. J. Vis. Exp. (41), e2034, doi:10.3791/2034 (2010).

RNA의 성적은 RNA 결합 단백질의 수백 (RBPs)와 microRNA 함유 자주 dependently 셀 타입에 표현 ribonucleoprotein의 단지 (miRNPs를.)와 상호 작용하여 포스트 transcriptional 유전자 규정의 대상이 아르 이해하는 방법을 다음과 RNA 바인딩 요소의 상호 작용은 개인 성적, 생체내 단백질 - RNA 상호 작용 ¹ 필요의 고해상도지도의 규정에 영향을 미칩니다.

유전자, 생화학 및 전산 접근 방식의 조합은 일반적으로 RNA - RBP 또는 RNA - RNP 상호 작용을 파악하기 위해 적용됩니다. immunopurified의 RBPs과 관련된 RNAS의 Microarray 프로 파일링 (RIP - 칩) ² transcriptome 수준 목표를 정의하지만, 그 응용 프로그램은 kinetically 안정적인 상호 작용에만 드문 경우 ^3,4는 RBP 인식 요소 (RRE을 식별할 수의 특성으로 제한됩니다 ) 긴 목표 RNA 이내. 더 직접적인 RBP 대상 사이트 정보 가교 RNA 세그먼트와 cDNA 시퀀싱 (CLIP) ^10의 절연 다음 immunoprecipitation ^7-9로 생체내의 자외선 crosslinking ^5,6에 결합하여 얻을 수 있습니다. 클립 RBPs ^11-17의 다수의 대상을 식별하는 데 사용되었다. 그러나, 클립 UV 254 nm의 RNA - 단백질 crosslinking의 낮은 효율에 의해 제한되며, crosslink의 위치는 어려운 배경 이외의 가교에서 UV - 가교 대상 RNA 세그먼트를 분리하고, 합성 가교 조각 이내에 쉽게 식별이되지 않습니다 RNA는 또한 샘플에 존재 조각.

우리는 높은 해상도와 셀룰러 RBPs 및 miRNPs의 transcriptome 전체 바인딩 사이트에서 확인하기 위해 강력한 세포 기반 crosslinking 접근을 개발 우리가 용어 PAR - 클립 (Photoactivatable - Ribonucleoside 강화 Crosslinking 및 Immunoprecipitation) (개요에 대한 그림. 1A를 참조하십시오 방법). 방법은 살아있는 세포에 의해 초기 RNA의 성적에 같은 4 - thiouridine (4 - SU)과 6 - thioguanosine (6 - SG)로 photoreactive ribonucleoside의 analogs의 결합에 의존하고 있습니다. 365 NM의 자외선에 의한 세포의 방사선이 상호 작용 RBPs에 photoreactive 뉴클레오 - 라벨 세포 RN​​AS의 효율적 crosslinking을 유도. 관심 RBP의 Immunoprecipitation은 가교와 coimmunoprecipitated RNA의 분리옵니다. 절연 RNA는 cDNA 라이브러리로 변환하고 깊은 Solexa 기술을 사용하여 합성 수 있습니다. PAR - 클립 준비한 cDNA 라이브러리 중 하나 특징은 crosslinking의 정확한 위치가 합성 cDNA에 거주하는 돌연변이에 의해 식별 될 수있다는 것이다. 변이를 아데노신에 구아 노신 6 - SG 결과를 사용하는 반면 cytidine 전환 4 - SU을 사용하여, 가교 시퀀스 thymidine. 가교 시퀀스에있는 돌연변이의 존재는 그것이 가능한 풍부한 휴대 RNAS에서 파생 시퀀스의 배경에서 분리 수 있습니다.

다양한 RNA 바인딩 단백질의 숫자 방법의 응용은 Hafner 외에 보도되었다. ¹⁸

아래의 프로토콜 HEK293 세포가 깃발을 표현 / doxycycline와 유도시 IGF2BP1을 HA - 태그에 대한 PAR - 클립 절차를 설명합니다. 우리는 immunoprecipitation를위한 안티 - 플래그 항체를 사용합니다.

PAR - 클립 immunoprecipitation를위한 효율적인 항체를 사용할 경우 모든 세포주 관심의 RNA 결합 단백질 (RBP)를 태그가 지정되지 않은 내생의 감지 수준을 표현과 함께 작동합니다.

확대 셀

1. 성장 매체 FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 세포를 확장합니다. 우리는 출발점으로 100-400 X 10 ⁶ 세포 (약 10-40 15cm의 세포 배양 접시) 사이에 사용하는 것이 좋습니다. 약 80 % confluency로 성장합니다.
2. crosslinking 전에 14 H는 직접 세포 배양 매체 100 μm의의 최종 농도 (1 M 4 thiouridine 주식 솔루션 1:1000 V / V)에) 4 thiouridine를 추가하고 B) 국기 / HA의 표현을 유도 doxycycline (10 MG / ML doxycycline 주식 솔루션의 1:10,000 V / V) 1 μg / ML를 추가로 IGF2BP1 태그. 참고 : 대신 4 thiouridine의 당신은 또한 6 thioguanosine 100 μm의를 사용할 수 있습니다.

UV - Crosslinking

1. 판 당 10 ML 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 한 번 씻고 완전히 PBS를 제거합니다.
2. 얼음 0.15 J / cm ^2의 365 nm의 Stratalinker 2400에서 자외선 (Stratagene) 또는 유사한 장치와 덮개 비추다있는 트레이에 플레이스 번호판입니다.
3. 50 ML의 원심 분리 튜브에 판, 전송 당 1 ML PBS에서 고무 경찰과 세포를 긁어 4 ° C에서 5 분 500 XG에서 원심 분리하여 수집하고 뜨는 폐기하십시오. 100 X 10 ⁶ HEK293 세포 (10 15cm 접시) 약 얻을 것입니다. 서부 유럽 표준시 세포 펠렛 1 ML.
4. (옵션)가 세포 lysis와 직접 계속하기를 원하지 않는다면, 충격 -80에서 액체 질소와 매장의 셀입니다 펠렛 ° C.를 동결 세포 펠렛은 최소한 12 개월 저장할 수 있습니다.

세포 용해와 RNaseT1 다이제스트

1. 1X NP40 용해 버퍼 3 권 가교 세포의 세포 펠렛을 타고 10 분 얼음에 품어.
2. 4 15 분 13,000 XG에서 원심 분리에 의해 삭제 세포 lysate ° C.
3. 0.2 μm의 멤브레인 필터 주사기 (팔 Acrodisc 또는 이에 상응하는 금액)를 통해 필터링하여 더욱 lysate를 삭제합니다.
4. 22 1 U / 15 분 물 목욕에 μl와 부화 ° C.의 최종 농도 RNase T1을 (Fermentas, 10,000 U / μl) 추가 계속하기 전에 얼음 5 분 이후 쿨 반응.

Immunoprecipitation 및 가교 대상 RNA 조각의 복구

자기 분리기를 사용하여

밖으로 건조에서 자기 구슬을 방지하기 위해 샘플 준비 전반에 걸쳐 다음 지침을 따르십시오.

1. 1 2 분 동안 자기 증언대에 구슬이 들어있는 튜브를 놓습니다.
2. 튜브는 자기 기호에있는 동안 튜브에 버퍼를 추가합니다.
3. 튜브 뚜껑, 자석 구분에서 제거하고, 구슬을 resuspend. 당신은 손가락으로 튜브를 flicking하여 구슬을 resuspend 또는 5 6 세트 vortexer을 사용할 수 있습니다.
4. 튜브 뚜껑에 남아있을 수있는 구슬을 수집하기 위해 간단히 원심 분리기.
5. 필요에 따라 1-4 단계를 반복합니다.

자기 구슬의 준비

1. Dynabeads의 단백질 G 자성 입자의 10 μl (Invitrogen) 당 ML 세포 lysate를 전송 (이것은되어야 일반적인 실험을 위해 약. 구슬 40 50 μl) 1.5 ML의 microfuge 튜브 있습니다. 구연 산염 인산 버퍼 1 ML로 두 번 구슬을 씻으십시오.
2. 비드 정지의 원래 볼륨에 비해 구연 산염 인산 버퍼의 두 배 볼륨 Resuspend.
3. 안티 - 플래그 M2 단클론 항체의 0.25 μg (시그마) 실온에서 40 분에 회전 바퀴에서 당 ML 서스펜션과 부화를 추가합니다.
4. 언바운드 항체를 제거하는 구연 산염 인산 버퍼 1 ML에 두 구슬을 씻으십시오.
5. 비드 정지의 원래 볼륨에 비해 구연 산염 인산 버퍼의 두 볼륨에 비즈를 Resuspend.

Immunoprecipitation (IP), 둘째 RNase T1의 소화 및 dephosphorylation

1. 부분 RNase T1 취급 세포 lysate의 ML 당 신선한 항체 - 복합 자석 구슬 20 μl를 추가하고 4 1 H에 대한 회전 바퀴 15 ML의 원심 분리 튜브에 품어 ° C.
2. 15 50 ML 원심 분리 튜브 (Invitrogen)에 대한 자성 입자 수집기에 자기 구슬을 모아 1.5 ML의 microfuge 튜브로 전송할 수 있습니다.
3. IP 세척 버퍼 1 ML에 구슬에게 3 번 씻으십시오.
4. 100 U / μl의 최종 농도 RNaseT1을 (Fermentas, 10,000 U / μl) 추가 22 15 분 물 목욕에 비드 현탁액을 품어 ° C. 얼음 이후 쿨5 분.
5. 높은 소금 세척 버퍼 1 ML에 구슬에게 3 번 씻으십시오.
6. dephosphorylation 버퍼 1 볼륨에 Resuspend 비즈
7. 0.5 U / μl의 최종 농도 송아지 장 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (채워, 코)을 추가, 37 10 분 정학을 품어 ° C.
8. 인산 가수 분해 효소 세척 버퍼 1 ML 두 번 구슬 와시
9. 두 폴리 뉴클레오 타이드 키나제 (PNK) 버퍼에 DTT (효소 반응에 필요한 DT​​T 농도 자기 구슬을 손상 정도로 높습니다)하지 않고 구슬을 씻으십시오.
10. PNK 버퍼 중 하나가 원래 비즈 볼륨 Resuspend 비즈

immunoprecipitated 단백질 가교 RNA 세그먼트의 Radiolabeling

1. 위에서 설명한 비드 중지, 1 U / 한 원래의 구슬 볼륨 μl을 0.5 μCi / μl와 T4 PNK의 최종 농도 (코)에 Υ - ³² P - ATP를 추가합니다. 37 30 분 정학을 품어 ° C.
2. 100 μm의의 최종 농도를 구하고 37 또 다른 5 분 부화되지 않은 방사성 ATP를 추가 ° C.
3. DTT없이 PNK 버퍼 800 μl와 자성 비즈에게 5 번 씻으십시오.
4. SDS - PAGE 로딩 버퍼의 70 μl의 구슬을 Resuspend.

겔 조각에서 SDS - PAGE와 가교 RNA - 단백질 단지의 electroelution

1. 95에서 열 블록에서 5 분 radiolabeled 정학을 품어 ° C 변성 및 가교 RNA와 와동과 immunoprecipitated RBP을 해제합니다.
2. 분리기에 자성 비즈를 제거하고 깨끗한 1.5 ML의 microfuge 관에 뜨는을 전송하기만하면됩니다.
3. 40 뜨는의 μl 당 우물 Novex 비스 - 트리스 4-12% (Invitrogen) 프리 캐스트의 polyacrylamide 젤을로드하고 200 55 분에 대한 겔을 실행 V.
4. 겔 챔버를 해체하고 한 접시에 장착 떠나, 젤 해체. phosphorimager 용지 출력에 젤의 정렬을 촉진하기 위하여, 우리는 젤의 네 모퉁이의 세에 불균형 작은 세 개의 방사성 겔 조각을 이온 주입하는 것이 좋습니다. 방사성 젤 조각는 이전에 다음 ID로 radiolabeled 합성 oligonucleotides를 정화하는 데 사용되었다 젤에서 수집한 수 있습니다. 오염을 피하기 위해 플라스틱 필름 (예 : 사란 랩)에서 젤 싸서.
5. 1 H에 대한 무시 phosphorimager 화면 젤 노출하고 phosphorimager에 시각화.
6. 오리 엔테이션에 대한 이식 겔 조각을 사용하여 phosphorimager의 인쇄물 위에 젤 맞춥니다. RBP의 예상 크기 (IGF2BP1 약. 75 KDA)에 대응하고 D - 튜브 Dialyzer 미디 튜브로 전송 800 μl 1X SDS 실행 버퍼를 추가 밴드를 잘라 버릴거야.
7. 2 H. 100 V에서 버퍼를 실행 1X SDS의 가교 RNA - RBP 복잡한 Electroelute 겔에서 excised 및 제조 업체의 지시에 따라 800 μl SDS 실행 버퍼에 D - 튜브 Dialyzer 미디 (Novagen)에 electroeluted.

Proteinase K의 소화

1. 1.2 MG / ML의 최종 농도 Proteinase K (로체)의 또한 다음 electroeluate에 대하여 2X Proteinase K 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다. 55 30 분 품어 ° C.
2. 산성 페놀 / 클로로포름 / IAA 추출 (25:24:1, 산도 4.0) 클로로포름 추출에 의해 다음에 의해 RNA를 복구합니다. 글리코겐 1 μl를 (10 MG / ML 주식) 추가 에탄올 3 볼륨을 추가하여 RNA를 침전. 10.5 μl 물에 펠렛을 디졸브.

cDNA 라이브러리 준비와 깊은 시퀀싱

원래 작은 규제 RNAS ¹⁹ 복제에 대한 설명 표준 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜을 통해 복구된 RNA를 운반. 복구 RNA의 10.5 μl를 사용하여 20 μl 규모에서 설명하는 것처럼 첫 번째 단계, 3 '어댑터 내고이 진행되었습니다. Solexa 순서 어댑터 설명 집합을 사용합니다. 복구 RNA의 양에 따라 삽입하지 않고 5' - 어댑터 - 3' - 어댑터 제품은 추가 PCR 밴드로 cDNA의 증폭 후 검색됩니다. 이러한 경우에는, 소비세 3 % NuSieve에서 예상 크기의 긴 PCR 제품은 낮은 용융 점 아가로 오스 겔, Solexa 기술을 사용하여 GelElute 키트 (Qiagen)와 순서를 사용하여 겔 조각에서 PCR 제품을 elute. 한 Solexa 순서 실행은 보통 6 천만 순서 사이 내실수 RNA 바인딩 단백질의 바인딩 사이트의 transcriptome 넓은 범위에 대한 충분한 것을 읽습니다.

Bioinformatic 분석

순서주의 bioinformatic 분석 순서 대 번역되지 않은 코딩, 요구 사항 등 RNA 인식 요소 RBP이 가진 기본 바인딩 지역 (exonic 대 intronic으로 심사 RBP에 대한 RNA 구속력이 사이트에 의미있는 통찰력을 얻기 위해해야​​ 할 일이 읽습니다 순서). 읽는 순서는 게놈과 동부 표준시 데이터베이스에 대해 정렬해야합니다. 우리는 일반적으로 읽습니다 mappi를 사용하여을 한 불일치, 삽입 또는 시퀀스 클러스터 구축을 삭제까지 고유 게놈에 NG가 나서 더 이상 분석 수 읽습니다. 클러스터 합성의 특성 변이의 빈도는 6 - SG를 사용할 때 전환 4 - SU와 G를 사용하는 경우, C 전환하기 위해 T를 읽는 성공적으로 가교 시퀀스 나타내는 있습니다. 우리의 경험에서 4 - SU으로 표시 uncrosslinked RNAS는 약 20 %의 배경 돌연변이 속도를 보여줍니다. 이 속도는 약으로 증가합니다. crosslinking시 50~80%.

bioinformatic 분석에 대한 자세한 설명은 Hafner 외 의해 출판의 보충 자료에서 찾을 수 있습니다. ¹⁸

선택 단계

총 RNA에 4 thiouridine의 정관 수준의 결정

안정 100 μm의 사전 수확 4SU 16 H와 보충 매체 성장 후 관심 RBP을 표현하는 세포 라인에서 총 RNA를 분리. 제어로, 수확 전지는 4SU 또한없는 성장. 제조 업체의 지침에 따라 세탁 세포 펠렛을 Trizol 시약 (시그마) 3 권 외에하여 총 RNA를 분리. 또한 제조 업체의 프로토콜에 따라 Qiagen RNeasy를 사용하여 총 RNA를 정화했다. RNA 분리 및 분석하는 동안 4SU의 산화를 방지하기 위해 세척 버퍼와 후속 효소 단계를 0.1 MM dithiothreitol (DTT)을 추가합니다. 다이제스트 및 HPLC 분석을 위해 하나의 nucleosides에 dephosphorylated 총 RNA는 ²⁰ 전에 설명했다. 간단히, 30 μl 볼륨, 37 16 H에 대한 전체 RNA 투석을 40 μg을했다 품어 ° 0.4 U 세균 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (생물 워싱턴)와 0.09 U의 뱀 독이와 C phosphodiesterase (워싱턴 생물). 참조 표준으로, 합성 4SU - 라벨 RNA (우리가 standardly CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U 사용) 또한 효소 소화를 완료하는 데 그것을 제목을 사용합니다. Supelco 디스커버리 C18 (보세 위상 실리카 5 μm의 입자, 250 X 4.6 mm) 반대 위상 열 (펠폰트 PA, 미국)의 HPLC에 의해 ribonucleosides의 결과 혼합물을 분리합니다. HPLC 버퍼는 3 % acetonitrile (A)와 물에 90 % acetonitrile (B)에 0.1 M TEAA 있습니다. 15 분, 20 분 0으로 10 % B, 30 분 10-100%의 B에 대한 0 % B : isocratic 그라데이션을 사용합니다. 사이에 적용 세척은 HPLC의 컬럼을 청소 실행 5 분 100 % B을 적용합니다.

대표 결과

그림 1 (오른쪽 패널)은 세포 라인 플래그를 표현 / 4 - SU 6 - SG와 함께 IGF2BP1 HA - 태그와 수행 파 클립의 대표적인 결과를 보여줍니다. IGF2BP1 6 - SG의 crosslinking 효율 4 - SU에 대한 crosslinking 효율보다 낮은합니다. 낮은 crosslinking 효율 풍부한 세포 RN​​AS의 조각에서 파생된 시퀀스의 높은 배경에 결과되며, 따라서 덜 효율적인 photoreactive nucleosides를 사용할 때 실험을 축소 고려해야합니다.

그림 1의 왼쪽 패널은 잠재적으로 기존의 UV 254 나노미터 crosslinking에 비해 PAR - 클립에 사용할 수있는 다른 photoreactive 유리딘의 analogs를 사용하여 비교를 보여줍니다.

올바른 길이의 방사능 밴드의 강도는 당신에게 작은 RNA 순서 프로토콜 (소형의 cDNA 라이브러리 준비에 대한 단계별 설명을 통해 파 클립 실험이 효과가있다 당신이 수행하는 충분한 RNA을 고립 여부 좋은 생각을 제공합니다 RNAS 배열은) ^19에서 찾을 수 있습니다. 6 - SG를 사용할 때 전환 4 - SU와 G를 사용하여 C 전환하는 합성 읽는, T의 특성 변이의 빈도는 성공적으로 가교 시퀀스 나타내는 있습니다. 우리의 경험에서 4 - SU으로 표시 uncrosslinked RNAS는 약 20 %의 배경 돌연변이 속도를 보여줍니다. 이 속도는 약으로 증가합니다. crosslinking시 50~80%.

TT는 Alnylam 제약에 cofounder 과학 고문과 레굴루스 치료제에 대한 고문이다.

우리는 도움이 토론에 대한 Tuschl 연구소의 회원 감사합니다. MH는 도이쳐 Akademischer Austauschdienst (DAAD)가 지원됩니다. 이 작품은 스위스 국립 기금 부여 MZ에 # 3100A0 - 114001에 의해 지원되었다; TT는 HHMI의 조사이며, 자신의 실험실에서 연구는 NIH 보조금 GM073047과 MH08442과 스타 재단에 의해 지원되었다.

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