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में multicellular व्यवहार रिकॉर्डिंग Myxococcus xanthus समय चूक Microcinematography का उपयोग Biofilms

1, 2

1Department of Environmental Health Sciences, University of South Carolina (USC), 2Department of Biology, Syracuse University

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Cite this Article: में multicellular व्यवहार रिकॉर्डिंग Myxococcus xanthus समय चूक Microcinematography का उपयोग Biofilms

Taylor, R. G., Welch, R. D. Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography. J. Vis. Exp. (42), e2038, doi:10.3791/2038 (2010).

Abstract: में multicellular व्यवहार रिकॉर्डिंग Myxococcus xanthus समय चूक Microcinematography का उपयोग Biofilms

Δ proteobacterium Myxococcus xanthus के एक झुंड कोशिकाओं है कि एक सामूहिक, पर्यावरण cues के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में जटिल, गतिशील पैटर्न बनाने के संकेतों की एक श्रृंखला के माध्यम से समन्वय आंदोलन के रूप में कार्य के लाखों शामिल हैं. इन नमूनों आत्म आयोजन और आकस्मिक रहे हैं, वे व्यक्ति की कोशिकाओं के व्यवहार को देख कर नहीं किया जा भविष्यवाणी कर सकते हैं. एक समय चूक microcinematography ट्रैकिंग परख का प्रयोग, हम एम. में एक अलग आकस्मिक पैटर्न की पहचान की xanthus chemotaxis कहा जाता है, अपने # 1 स्रोत की ओर एक पोषक तत्व ढाल ऊपर एक झुंड के निर्देश आंदोलन के रूप में परिभाषित किया.

आदेश में कुशलतापूर्वक समय चूक microcinematography के माध्यम से chemotaxis विशेषताएँ करने के लिए, हम एक अत्यधिक परिवर्तनीय थाली जटिल विकसित (चित्रा 1) और 8 (चित्रा 2) सूक्ष्मदर्शी, कैप्चरिंग समय व्यतीत हो वीडियो के प्रत्येक सक्षम के एक क्लस्टर का निर्माण. परख काफी कठोर करने के लिए quantifiable डेटा के अनुरूप प्रतिकृति की अनुमति है, और जिसके परिणामस्वरूप वीडियो हमें का पालन और झुंड व्यवहार में सूक्ष्म परिवर्तन को ट्रैक की अनुमति देते हैं. एक बार कब्जा कर लिया है, वीडियो प्रक्रिया और वीडियो के हजारों स्टोर करने के लिए पर्याप्त स्मृति के साथ एक कंप्यूटर / विश्लेषण भंडारण के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. इस सेटअप का लचीलापन साबित कर दी है एम. के कई सदस्यों के लिए उपयोगी xanthus समुदाय.

Protocol: में multicellular व्यवहार रिकॉर्डिंग Myxococcus xanthus समय चूक Microcinematography का उपयोग Biofilms

आपूर्ति की जरूरत है:

  • Klett मीटर
  • विंदुक युक्तियाँ और
  • 2.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों
  • Microcentrifuge
  • CTTYE मीडिया:
    • 1.0% (Difco प्रयोगशालाओं) Casitone, 0.5% खमीर निकालने (Difco प्रयोगशालाओं)
    • 10.0 मिमी Tris - एचसीएल (पीएच 8.0), 1.0 मिमी 2 के.एच. पीओ 4, 8.0 मिमी MgSO 4
  • TPM मीडिया:
    • 10.0 मिमी Tris - एचसीएल (पीएच 8.0), 1.0 मिमी 2 के.एच. पीओ 4, 8.0 मिमी MgSO 4
  • Agarose
  • जल स्नान 55 के लिए सेट डिग्री सेल्सियस
  • ग्लास खुर्दबीन स्लाइड
  • बड़े गिलास coverslips
  • 2 एक्स 2 सेमी, 0.5 मिमी मोटी सिलिकॉन रबर गैसकेट (अनुग्रह इंक बायो लैब)
  • Parafilm (लेबलिंग या टेप)
  • चिमटा
  • लघु बांधने की मशीन क्लिप
  • लघु नमूने विंदुक (फिशर)
  • 100 μl कांच डिस्पोजेबल टिप (फिशर)
  • Kimwipes

भाग 1: सेल तैयार

एक बाँझ वातावरण बनाने के द्वारा शुरू करो.

  • स्वच्छ कार्यक्षेत्र, डॉन, दस्ताने, और प्रकाश बर्नर.
  1. कक्षों की एक रात संस्कृति CTTYE शोरबा युक्त कुप्पी में inoculating और 32 ° सी में अंधेरे में जोरदार घूमता साथ incubated द्वारा शुरू करो.
  2. एक बार संस्कृति 5 10 8 कोशिकाओं एक्स / एमएल, पिपेट एक 2.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 1 मिलीलीटर कोशिकाओं के घनत्व पर पहुंच गया.
  3. +१६००० XG (या अधिकतम गति) में 2 मिनट के लिए centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं.
  4. छानना और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  5. 1 मिलीलीटर TPM (नमक संतुलित, पोषक तत्वों से मुक्त मीडिया) के साथ सेल गोली धो लें.
    • फिर निलंबित और भंवर
  6. +१६००० XG (या अधिकतम गति) में 2 मिनट के लिए कताई द्वारा पुन गोली कोशिकाओं.
  7. छानना और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.

    महत्वपूर्ण कदम

  8. पूरी तरह से 100 μl TPM pipetting और vortexing का एक संयोजन का उपयोग कर मीडिया में गोली पुनः निलंबित.

    महत्वपूर्ण: यह कदम यह सुनिश्चित करता है कि वहाँ ट्यूब में छोड़ दिया कक्षों की कोई clumps हैं. यह एक समय लग सकता है.
  9. कोशिकाओं तरफ कमरे के तापमान पर सेट जबकि ट्रैकिंग परख प्लेटों की तैयारी.

भाग 2: अग्रवाल तैयारी

  1. दोनों TPM (परख मीडिया) और (पोषक डिस्क) CTTYE मीडिया के 50 मिलीलीटर की तैयारी.
  2. प्रत्येक (agarose अगर तुलना में कम diffractive है) 0.5 ग्राम agarose जोड़ें.
  3. बाँझ आटोक्लेव.
  4. नसबंदी के बाद 55 में मीडिया को बनाए रखने ° इनक्यूबेटर में सी (या पानी स्नान) जबकि ट्रैकिंग परख थाली परिसरों के निर्माण के.

भाग 3: पौष्टिक डिस्क का निर्माण

  1. एक बाँझ एक लौ निष्फल ग्लास खुर्दबीन स्लाइड के शीर्ष पर 0.5 मिमी मोटी सिलिकॉन रबर गैसकेट प्लेस, एक छोटे से अच्छी तरह से बनाने.
  2. पिपेट ~ 55 के 300 μl ° C CTTYE मीडिया / agarose में अच्छी तरह से स्लाइड पर पाल बांधने की रस्सी के द्वारा बनाई गई और पोषक डिस्क युक्त. CTTYE मीडिया / agarose टीले ऊपर होना चाहिए.
  3. CTTYE मीडिया / agarose के शीर्ष पर एक लौ निष्फल स्लाइड (कोई गैसकेट के साथ) रखें.

    महत्वपूर्ण: इस स्लाइड बनाने से बुलबुले को रोकने के कोण पर नीचे सेट करना होगा.
  4. प्रत्येक पक्ष पर एक - एक बार जगह में स्लाइड है, जटिल मिनी बांधने की मशीन क्लिप के साथ एक साथ दबाना है.
  5. 4 में काटा जटिल प्लेस ° सी और CTTYE मीडिया / agarose सेट करने की अनुमति. यह आमतौर पर के बारे में 5 मिनट लगते हैं.

भाग 4: ट्रैकिंग परख तैयार - प्लेट परिसर सेट

घटकों को इकट्ठा करने के लिए, स्लाइड परिसरों तैयार, पोषक डिस्क स्थान, TPM मीडिया / agarose, अलग और सूखी थाली परिसरों, थाली कोशिकाओं, और परख थाली परिसरों ट्रैकिंग इकट्ठा डालना.

थाली जटिल घटकों को इकट्ठा

  1. प्रत्येक परिसर के लिए, लौ एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड निष्फल
  2. स्लाइड के शीर्ष पर एक autoclaved गैसकेट प्लेस और अलग सेट (ओर निष्फल ऊपर). इस परख के नीचे के फार्म का होगा.
  3. ज्वाला एक गिलास कवर पर्ची और एक दूसरे गिलास खुर्दबीन लेबलिंग टेप (या Parafilm) के साथ लिपटे स्लाइड के शीर्ष पर यह जगह है और अलग सेट (ओर निष्फल ऊपर) बाँझ. यह समर्थन करने के लिए खुर से coverslip रखने स्लाइड के रूप में प्रयोग किया जाता है. इस परख के शीर्ष फार्म का होगा.
  4. ज्वाला एक तिहाई गिलास खुर्दबीन स्लाइड बाँझ और अलग सेट (ओर निष्फल ऊपर). यह agarose समतल करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.

    महत्वपूर्ण: सुनिश्चित करें कि gaskets संदंश के साथ नीचे दबाकर गिलास के साथ एक मुहर के रूप में, अन्यथा मीडिया agarose / के बाहर सूखी हो सकता है.

पी पोषक डिस्क फीता

महत्वपूर्ण: 10 के माध्यम से 5 कदम एक समय में एक स्लाइड जटिल किया जाना चाहिए, अन्यथा मीडिया / agarose करने के लिए गरीब फिल्म की गुणवत्ता में जिसके परिणामस्वरूप जमना शुरू कर सकता है.

  1. पोषक डिस्क जटिल फार्म निकालें 4 डिग्री सेल्सियस (भाग 3 से 5 कदम) और अलग अब जम CTTYE / agarose उजागर स्लाइड्स जिज्ञासा.
  2. 1 मिमी व्यास CTTYE मीडिया / agarose से पोषक डिस्क 'अच्छी तरह से एक 100 μl कांच डिस्पोजेबल टिप के साथ एक नमूना सूक्ष्म पिपेट का उपयोग करके उपरोक्त वर्णित निकालें और यह अच्छी तरह से कवर पर्ची (3 कदम ऊपर) पर पाल बांधने की रस्सी के द्वारा बनाई गई जगह .

प्लेटों डालो

महत्वपूर्ण कदम

  1. ~ पिपेट μl 55 के 300 ° सी TPM मीडिया / agarose में अच्छी तरह से कवर पर्ची और पोषक डिस्क युक्त पर पाल बांधने की रस्सी के द्वारा बनाई गई. TPM मीडिया / agarose टीले ऊपर होना चाहिए.

    महत्वपूर्ण कदम
  2. TPM मीडिया / agarose के शीर्ष पर कोई गैसकेट (3 कदम से) के साथ स्लाइड लौ निष्फल रखें.

    महत्वपूर्ण: इस स्लाइड बनाने से बुलबुले को रोकने के कोण पर नीचे सेट करना होगा.

  3. प्रत्येक पक्ष पर एक - एक बार स्लाइड (कदम 5 से) में जगह है, जटिल मिनी बांधने की मशीन क्लिप के साथ एक साथ दबाना है.
  4. 4 में काटा जटिल प्लेस ° सी और मीडिया / agarose सेट करने के लिए अनुमति देते हैं. यह आमतौर पर के बारे में 5 मिनट लगते हैं.

अलग और सूखी प्लेटें

महत्वपूर्ण: करने के लिए बाहर सुखाने से मीडिया / agarose रोकने के कदम 11 20 के माध्यम से एक समय में केवल एक स्लाइड परिसर पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

महत्वपूर्ण: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, 13 के माध्यम से 11 कदम 4 में प्रदर्शन किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस

  1. एक बार मीडिया / agarose सेट है, बांधने की मशीन क्लिप हटाने और परिसर के अंत निचोड़ करने के लिए स्लाइड टेप लिपटे ढीला.
  2. स्लाइड टेप लिपटे निकालें और इसे आगे उपयोग के लिए बेंच पर जगह है.

    महत्वपूर्ण कदम
  3. एक कील के रूप में संदंश का प्रयोग, समर्थन स्लाइड (कोई गैसकेट के साथ) से कवर पर्ची / गैसकेट / / मीडिया agarose जटिल अलग और समर्थन स्लाइड त्यागें.

    महत्वपूर्ण: prying गति का उपयोग करने के लिए कवर पर्ची / गैसकेट जटिल अलग मत करो. यह कवर पर्ची तोड़ने और / या मीडिया / agarose समर्थन स्लाइड करने के लिए चिपके हुए में परिणाम सकता है.
  4. कवर पर्ची / टेप लिपटे स्लाइड पर गैसकेट / / मीडिया agarose जटिल (गैसकेट तरफ ऊपर) प्लेस और 4 से हटाने डिग्री सेल्सियस इस जटिल एक बर्नर के लिए अगले प्लेस सभी दृश्यमान नमी नव उजागर सतह / मीडिया agarose से लुप्त हो जाना करने की अनुमति - से अधिक नहीं 1 मिनट.

    महत्वपूर्ण: मीडिया / agarose सूखी भी इस रूप में लंबे समय के लिए मत एम. प्रभाव सकता है xanthus झुंड व्यवहार.

प्लेट कोशिकाओं

महत्वपूर्ण कदम

  1. एक बार अतिरिक्त नमी को सुखाया, पिपेट / मीडिया agarose लगभग 1 पोषक डिस्क से दूर मिमी (1 भाग से चरण 8) पर ध्यान केंद्रित किया कोशिकाओं का 0.5 μl.

    महत्वपूर्ण: यह अत्यंत महत्वपूर्ण है यकीन है कि कोशिकाओं विंदुक सीधे नीचे और फिर सीधे ऊपर जा करके जमा कर रहे हैं बनाना. यह सुनिश्चित करता है कि झुंड परिपत्र जाएगा.

    महत्वपूर्ण: यह बेहद जरूरी है / मीडिया agarose विंदुक टिप नहीं स्पर्श है. यह सतह पर एक अवसाद और एम. के व्यवहार बदल जाएगा xanthus झुंड.

    सुझाव: पहले मीडिया / agarose आ विंदुक टिप दबाना. इस कक्षों की एक बूंद विंदुक टिप के तल पर दिखाई करने के लिए और यह आसान कोशिकाओं को जमा करने के लिए बनाने की अनुमति देगा.
  2. एक बार कोशिकाओं जमा कर रहे हैं, जटिल बर्नर करने के लिए अगले सेल हाजिर शुष्क करने की अनुमति जगह - कोई अधिक से अधिक 20 सेकंड.

परख इकट्ठा

  1. एक बार सेल हाजिर सूख गया है, कवर पर्ची / गैसकेट / / मीडिया agarose / जटिल सेल (13 कदम से) पर गैसकेट के साथ जटिल / स्लाइड गैसकेट (1 कदम से) संरेखित करें और धीरे से एक साथ प्रेस के लिए एक मुहर के रूप में.

    महत्वपूर्ण कदम
  2. स्लाइड की सतहों को साफ और एक Kimwipe साथ पर्ची कवर करने के लिए Parafilm द्वारा छोड़ा अवशेषों को हटाने. पूरा परख चित्रा 1 सदृश चाहिए.
  3. गर्म 32 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा मंच पर पूरा स्लाइड जटिल प्लेस (स्लाइड नीचे, पर्ची कवर) के तुरंत बाद नीचे पोंछ (15 कदम) संक्षेपण फार्म के गठन को रोकने के. यदि संक्षेपण का गठन किया है, कई सेकंड के लिए छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करने से पहले गर्म मंच पर स्लाइड जटिल बैठो चलो.
  4. उपयुक्त उद्देश्य (2X, 4X, या 10X) चुनें.

भाग 5: मूवी तैयारी

टी "> महत्वपूर्ण कदम

  1. कैमरा और माइक्रोस्कोप पर मुड़ें, और प्रकाश के स्तर की जाँच करें (सुनिश्चित करें कि प्रकाश भी तीव्र नहीं है). कंप्यूटर को प्रारंभ करें और छवि अधिग्रहण कार्यक्रम खुला.
  2. लाइव छवि विंडो क्लिक करें और खुर्दबीन ध्यान केंद्रित. चित्रा 3 में देखा एक के लिए इसी तरह की छवि प्रकट करना चाहिए. वर्दी अगर सतह सूचना.
  3. छवियों को प्राप्त करने शुरू करो.

    महत्वपूर्ण कदम
  4. ध्यान नियमित रूप से पहले घंटे के दौरान, चेक के रूप में मीडिया / अगर ध्यान केंद्रित बहाव के कारण व्यवस्थित आदत.
  5. कार्य क्षेत्र को साफ.
  6. एक बार छवि अधिग्रहण पूरा हो गया है, स्थानांतरण भंडारण के लिए छवियों को हासिल कर लिया और 90% इथेनॉल में रातोंरात भिगोने द्वारा स्लाइड जटिल नीचे तोड़ने.
  7. पुन: उपयोग के लिए आटोक्लेव gaskets.

चित्रा 1
चित्रा 1 टीएम प्लेट परिसर के कार्टून चित्रण. (ए) विस्फोट दृश्य और पार अनुभाग में बुनियादी टीएम थाली परिसर से पता चलता है. (ख) बड़े gaskets के उपयोग से पता चलता है.

चित्रा 2
चित्रा 2 माइक्रोस्कोप क्लस्टर. प्रत्येक खुर्दबीन नोड (इनसेट) एक Nikon E400 माइक्रोस्कोप, उद्देश्यों, एक गर्म चरण, एक इनसाइट कैमरा, और एक नोटबुक कंप्यूटर के होते हैं. प्रत्येक नोड एक साथ नेटवर्क है और एक मास्टर नियंत्रक कंप्यूटर से जुड़ा हुआ है. दो नोड्स के प्रतिदीप्ति क्षमताओं है कि EXFO प्रकाश स्रोत और दो Uniblitz बंद से मिलकर बनता है के साथ स्थापित कर रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. ट्रैकिंग परख तंत्र की एक 20X छवि समय पर = 0. स्केल बार, 1 मिमी.

चित्रा 4
चित्रा 4 टीएम थाली परिसर की अनुकूलनशीलता. (ए) एम. के एक 100X छवि अगर में 1.0% xanthus ग्लाइडिंग CTTYE पर गतिशीलता. (बी) पी. के एक 20X छवि हिल aeruginosa गतिशीलता. (सी) एक 20X छवि एस. रेंगनेवाले marcescens गतिशीलता. दोनों (बी) और (सी) लेग पर 1.0% अगर में assayed थे. (डी) एम. के एक 40x छवि smegmatis लेग पर 0.5% अगर में गतिशीलता फिसलने. इस छवि वैकल्पिक परख चित्र 1B में देखा विन्यास का उपयोग कर कब्जा कर लिया था.

वीडियो 1. ट्रैकिंग परख के अधीन झुंड की एक समय व्यतीत हो वीडियो.

वीडियो 2 एम. के समय चूक वीडियो xanthus झुंड कक्षों की 1% fluorescently जहां लेबल रहे हैं. बारी चरण विपरीत और फ्लोरोसेंट छवियों पर कब्जा कर लिया और झुंड के भीतर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की स्थिति को स्पष्ट करने के लिए मढ़ा गया. 1.0% अगर में इस वीडियो CTTYE पर कब्जा कर लिया था.

वीडियो 3. एम. के समय चूक वीडियो xanthus ग्लाइडिंग गतिशीलता. 1.0% अगर में इस वीडियो CTTYE पर कब्जा कर लिया था.

वीडियो 4. पी. की एक समय व्यतीत हो वीडियो हिल aeruginosa गतिशीलता. इस वीडियो में 1.0% की अगर में लेग पर कब्जा कर लिया था.

5 एस के एक समय चूक वीडियो वीडियो. रेंगनेवाले marcescens गतिशीलता. इस वीडियो में 1.0% की अगर में लेग पर कब्जा कर लिया था.

6 वीडियो एम. की एक समय व्यतीत हो वीडियो. smegmatis गतिशीलता फिसलने. यह वीडियो वैकल्पिक परख चित्र 1B में देखा विन्यास का उपयोग कर 0.5% अगर लेग पर कब्जा कर लिया था.

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Discussion: में multicellular व्यवहार रिकॉर्डिंग Myxococcus xanthus समय चूक Microcinematography का उपयोग Biofilms

समय चूक microcinematography (टीएम) prokaryotic 2-7 गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक मानक दृष्टिकोण बन गया है. परंपरागत रूप से, टीएम 8-11 substrates के रूप में फिल्टर पेपर wicks, पतली अगर पैड, या अगर स्लैब का उपयोग करके किया जाता है. इन विधियों पर्याप्त और लागत प्रभावी हैं जब बैक्टीरियल आंदोलन के सामान्य चित्रों के लिए छवि अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया. हालांकि, अगर छवि अनुक्रम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मात्रात्मक कठोर डेटा की पीढ़ी में परिणाम चाहिए, इन तरीकों समय लेने और कुछ हद तक अविश्वसनीय हैं. उदाहरण के लिए, मानव त्रुटि की वजह से इन तकनीकों में बदलाव है कि नाटकीय रूप से बैक्टीरिया का व्यवहार परख सब्सट्रेट के एक ओर से फोकल हवाई जहाज़ में अंतर करने के लिए अध्ययन प्रभावित हो सकता है अगर सतह में अनियमितताओं से inaccuracies की एक विस्तृत सरणी के लिए, सीसा सकता है दूसरे के लिए. इन समस्याओं को हल करने के लिए, हम एक टीएम थाली जटिल है कि पर्याप्त अनुरूप गुणवत्ता सिलिकॉन gaskets कि दोनों सस्ती और पुन: प्रयोज्य (1 छवि) द्वारा रोजगार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम के है डिजाइन किए हैं. इसके अलावा, थाली जटिल अत्यधिक परिवर्तनीय है और हाइड्रेटेड और मीडिया प्रकार और अगर सांद्रता की एक किस्म में एक सप्ताह से अधिक समय के लिए पर्याप्त oxygenated रहने साबित.

समय चूक फिल्मों की पीढ़ी की सुविधा के लिए, 8 Nikon E400 सूक्ष्मदर्शी 2X, 4X, और 10X प्रत्येक उद्देश्यों के साथ outfitted थे. इसके अलावा, एक इनसाइट (निदानिकि उपकरण, Inc), कैमरा, और एक गर्म चरण (20/20 टेक्नोलॉजीज) प्रत्येक माइक्रोस्कोप के लिए अधिग्रहीत किया गया था. प्रत्येक कैमरा एक नोटबुक कंप्यूटर है जिस पर अत्यधिक परिवर्तनीय छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर स्पॉट (निदानिकि उपकरण, Inc) स्थापित किया गया था करने के लिए जोड़ा गया था. सभी विभिन्न घटकों नोड्स, एक खुर्दबीन, तीन उद्देश्यों, एक इनसाइट कैमरा, एक गर्म चरण, और नियंत्रण कंप्यूटर से मिलकर प्रत्येक में इकट्ठे हुए थे. आठ नोड्स के प्रत्येक एक साथ एक क्लस्टर में नेटवर्क थे और जो संकलन, विश्लेषण, और समय चूक वीडियो क्लस्टर (छवि 2) द्वारा उत्पन्न की दुकान करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक भंडारण कंप्यूटर से जुड़ा हुआ है. भंडारण कंप्यूटर एक 1 terabyte RAID प्रणाली, जो क्लस्टर द्वारा उत्पन्न डेटा की विशाल राशि की दुकान करने की जरूरत है के साथ outfitted था.

एक बार जब पूरा, थाली जटिल माइक्रोस्कोप के गर्म मंच पर रखा गया है और ट्रैकिंग परख शुरू की है. छवियाँ है कि कक्षों की गतिशीलता की दर के आधार पर निर्धारित कर रहे हैं पूर्व निर्धारित अंतराल पर प्राप्त कर लिया हैं. उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत एम. xanthus कोशिकाओं प्रति मिनट लगभग एक सेल लंबाई के एक दर पर चलते हैं. यदि छवियों एम. अर्जित कर रहे हैं xanthus झुंड है कि एक ही दर प्रति मिनट (एक छवि) पर है, जिसके परिणामस्वरूप समय चूक वीडियो प्लेबैक के दौरान चिकनी दिखाई देगा. एक बार छवि अधिग्रहण पूरा हो गया है, छवियों को एक अनुक्रमिक मैट्रिक्स में संकलित कर रहे हैं और पर्याप्त दर है कि वे (Video. 1) हो रहा दिखाई देते हैं पर वापस खेला. अब यह समय चूक वीडियो एक किस्म सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया जा सकता है.

परख पर विविधतायें टीएम थाली जटिल अत्यधिक परिवर्तनीय और एक किस्म की शर्तों के तहत कई अलग अलग सूक्ष्मजीवों कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. झुंड दृश्य चरण के विपरीत (जो एक एकल इकाई के रूप में झुंड के व्यवहार रिकॉर्ड) माइक्रोस्कोपी, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (जो व्यक्ति फ्लोरोसेंट कोशिकाओं है कि एक गैर फ्लोरोसेंट जनसंख्या में पतला है के व्यवहार रिकॉर्ड), या एक संयोजन का उपयोग किया जा सकता है है दोनों (जो अनुक्रमिक चरण विपरीत और फ्लोरोसेंट छवियों बारी overlays) (2 वीडियो). थाली परिसर को सफलतापूर्वक सहित एम. समय चूक कई prokaryotic व्यवहार के वीडियो उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है xanthus ग्लाइडिंग गतिशीलता, Pseudomonas aeruginosa हिल गतिशीलता, Seratia गतिशीलता रेंगनेवाले marcescens, और उपन्यास माइकोबैक्टीरियम smegmatis फिसलने गतिशीलता (4 छवि और वीडियो 3-6).

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Disclosures: में multicellular व्यवहार रिकॉर्डिंग Myxococcus xanthus समय चूक Microcinematography का उपयोग Biofilms

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements: में multicellular व्यवहार रिकॉर्डिंग Myxococcus xanthus समय चूक Microcinematography का उपयोग Biofilms

यह शोध एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर RDW पुरस्कार (MCB ०७,४६,०६६, transcriptional activators की विशेषता है कि आकस्मिक व्यवहार को विनियमित) के द्वारा ही संभव बनाया गया था

हम LJ Shimkus, बी गोल्डमैन, जी Suen, एम. गायक, एलजी वेल्च, के.ए. मर्फी, और पारा टेलर पांडुलिपि पर उपयोगी विचार - विमर्श और टिप्पणियों के लिए आभारी हैं.

Materials: में multicellular व्यवहार रिकॉर्डिंग Myxococcus xanthus समय चूक Microcinematography का उपयोग Biofilms

Name Company Catalog Number Comments
1.0% Casitone Difco Laboratories
0.5% yeast extract Difco Laboratories
Micro-sampling pipette Fisher Scientific
100 l glass disposable tip Fisher Scientific
2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket Grace Bio-Lab Inc.

References: में multicellular व्यवहार रिकॉर्डिंग Myxococcus xanthus समय चूक Microcinematography का उपयोग Biofilms

  1. Taylor, R. G. & Welch, R. D. Chemotaxis as an emergent property of a swarm. J Bacteriol 190, 6811-6816 (2008).
  2. Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D. & Shimkets, L. J. Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation. J Bacteriol 189, 9126-9130 (2007).
  3. Mignot, T., Merlie, J. P. & Zusman, D. R. Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein. Science 310, 855-857 (2005).
  4. Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. & Lappin-Scott, H. M. Detachment, surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging. Methods Enzymol 337, 306-319 (2001).
  5. O'Toole, G., Kaplan, H. B. & Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol 54, 49-79 (2000).
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