Comportamento de gravação em multicelulares Myxococcus xanthus Os biofilmes usando lapso de tempo Microcinematography

Suprimentos necessários:

• Klett metros
• Pipeta e dicas
• 2,5 ml tubos de microcentrífuga
• Microcentrífuga
• CTTYE mídia:
  • Casitone 1,0% (Difco Laboratories), extrato de levedura 0,5% (Difco Laboratories),
  • 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH ₂ PO _4, 8,0 mM MgSO ₄
• TPM mídia:
  • 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH ₂ PO _4, 8,0 mM MgSO ₄
• Agarose
• Banho-maria regulado a 55 ° C
• Microscópio de lâminas de vidro
• Grandes lamínulas de vidro
• 2 x 2 cm, 0,5 mm de espessura de silicone junta de borracha (Grace Bio-Lab Inc.)
• Parafilme (ou fita rotulagem)
• Fórceps
• Pequenos grampos da pasta
• Micro-amostragem de pipetas (Fisher)
• 100 gorjeta de copo descartável mL (Fisher)
• Kimwipes

Parte 1: preparação celular

Comece por criar um ambiente estéril.

• Local de trabalho limpo, luvas don, e gravador de luz.

1. Iniciar uma cultura de células durante a noite através da inoculação em um frasco contendo caldo CTTYE e incubadas no escuro a 32 ° C, sob agitação vigorosa.
2. Uma vez que a cultura atingiu uma densidade de 5 x 10 ⁸ células / ml, pipetar 1 ml de células em um tubo de microcentrífuga de 2,5 ml.
3. Pellet células por centrifugação por 2 min a 16.000 xg (ou velocidade máxima).
4. Decantar e descartar o sobrenadante.
5. Lavar pellet celular com 1 ml TPM (sal equilibrada, nutritiva livre de mídia).
   • re-suspensão e vortex
6. Re-pellet células girando por 2 min a 16.000 xg (ou velocidade máxima).
7. Decantar e descartar o sobrenadante.
   
   ETAPA CRÍTICA
   
   
8. Completamente re-suspender pellet em 100 mL de mídia TPM usando uma combinação de pipetagem e vórtice.
   
   IMPORTANTE: Este passo garante que não existem aglomerados de células deixadas no tubo. Isso pode demorar um pouco.
9. Definir as células de lado em temperatura ambiente enquanto prepara os pratos ensaio de monitoramento.

Parte 2: Preparação Agar

1. Prepare 50 ml de ambos TPM (teste de mídia) e CTTYE (disco nutritivo) meios de comunicação.
2. Adicionar 0,5 g de agarose a cada (agarose é menos de difracção de agar).
3. Autoclave para esterilizar.
4. Após a esterilização, manter a media de 55 ° C em uma incubadora (ou banho-maria) durante a construção dos complexos placa de monitoramento do ensaio.

Parte 3: Construção Disk Nutritivo

1. Coloque uma junta de borracha estéril 0,5 mm de espessura de silicone em cima de uma chama-esterilizados lâmina de vidro, formando um pequeno poço.
2. Pipeta ~ 300 ml dos 55 ° C CTTYE media / agarose para o bem criado pela junta sobre a lâmina e que contém o disco nutritivo. A mídia CTTYE / agarose deve monte acima.
3. Coloque um slide chama esterilizados (sem junta) no topo da mídia CTTYE / agarose.
   
   IMPORTANTE: Este slide deve ser estabelecido em um ângulo para evitar a formação de bolhas.
4. Uma vez que o slide está no lugar, apertar o complexo juntamente com grampos da pasta mini - um de cada lado.
5. Coloque o complexo cortada a 4 ° C e permitir que a mídia CTTYE / agarose para definir. Isso geralmente leva cerca de 5 min.

Parte 4: Preparação de Ensaio Tracking - Configurar Placa Complexos

Montar os componentes, preparar os complexos de slides, coloque o disco nutritivo, despeje a mídia TPM / agarose, complexos de chapa separada e seca, as células da placa, e montar complexos de monitoramento da placa de ensaio.

Montar componentes placa complexo

1. Para cada complexo, chama esterilizadas uma lâmina de vidro
2. Coloque uma junta autoclavado em cima do slide e reserve (esterilizado lado para cima). Isto irá formar a parte inferior do ensaio.
3. Chama esterilizar uma tampa de vidro slip e colocá-lo em cima de um segundo slide de vidro de microscópio envolto com fita rotulagem (ou Parafilm) e reserve (esterilizado lado para cima). Isso é usado como um slide de apoio para manter as lamelas de rachar. Isto irá formar a parte superior do ensaio.
4. Chama esterilizar uma lâmina de microscópio terceiro copo e reserve (esterilizado lado para cima). Isso será usado para achatar a agarose.
   
   IMPORTANTE: Certifique-se que as juntas formar uma vedação com o vidro pressionando-o com uma pinça, caso contrário, a mídia / agarose pode secar.

P rendas disco nutritivo

IMPORTANTE: As etapas de 5 a 10 deve ser feito para um complexo de lâmina de cada vez, caso contrário a mídia / agarose poderia começar a solidificar, resultando em qualidade de filme ruim.

5. Remover o formulário de disco nutritivo complexo de 4 ° C (etapa 5 da parte 3) e erguer para além dos slides expondo a CTTYE agora solidificados / agarose.
6. Remover um 1 'disco nutritivo' mm de diâmetro da mídia CTTYE / agarose bem descrito acima, usando uma pipeta de amostragem micro-com uma ponta de vidro 100 ml descartáveis ​​e coloque-o no poço criado pela junta na lamínula (passo 3 acima) .

Preparar placas

ETAPA CRÍTICA

7. Pipeta ~ 300 ml dos 55 ° C TPM media / agarose para o bem criado pela junta na lamínula e que contém o disco nutritivo. A mídia TPM / agarose deve monte acima.
   
   ETAPA CRÍTICA
8. Coloque o slide chama esterilizadas sem junta (a partir do passo 3) no topo da mídia TPM / agarose.
   
   IMPORTANTE: Este slide deve ser estabelecido em um ângulo para evitar a formação de bolhas.
   
   
9. Uma vez que o slide (a partir do passo 5) estiver no lugar, apertar o complexo juntamente com grampos da pasta mini - um de cada lado.
10. Coloque o complexo cortada a 4 ° C e deixe o media / agarose para definir. Isso geralmente leva cerca de 5 min.

Pratos separados e secos

IMPORTANTE: Para evitar que o media / agarose de secar, os passos 11 a 20 só deve ser realizada em um complexo de lâmina de cada vez.

IMPORTANTE: Para melhores resultados, os passos 11 a 13 deve ser realizada a 4 ° C.

11. Uma vez que a media / agarose tem, retire a grampos da pasta e aperte o final do complexo para soltar o slide tape-embrulhado.
12. Remove o slide envolto em fita e colocá-lo no banco para uso posterior.
    
    ETAPA CRÍTICA
13. Utilizando uma pinça como uma cunha, separe os lamínula / junta / media / agarose complexo a partir do slide de apoio (sem junta) e descartar slides de apoio.
    
    IMPORTANTE: Não use um movimento para separar os curiosos lamínula / complexo junta. Isto poderia resultar na quebra lamínula e / ou a degola media / agarose para o slide apoio.
14. Coloque a lamínula / junta / media / agarose complexo no slide tape-envolvido (a junta lateral-se) e remover a partir de 4 ° C. Coloque este complexo próximo a um queimador para permitir que toda a umidade evapore visível a partir do recém-expostas superfície media / agarose - não mais de 1 min.
    
    IMPORTANTE: Não deixe que a seca media / agarose por muito tempo, pois isso pode impactar o M. xanthus comportamento enxame.

Células da placa

ETAPA CRÍTICA

1. Uma vez que o excesso de umidade tenha evaporado, pipetar 0,5 mL das células concentrado (passo 8 da parte 1) sobre a mídia / agarose aproximadamente 1 mm de distância do disco de nutrientes.
   
   IMPORTANTE: É extremamente importante certificar-se que as células são depositadas movendo a pipeta para baixo e depois para cima. Isso garante que o enxame será circular.
   
   IMPORTANTE: É extremamente importante para não tocar a ponta da pipeta para a mídia / agarose. Isso fará com que uma depressão na superfície e mudar o comportamento do M. xanthus enxame.
   
   DICA: Pressione a ponta da pipeta antes de se aproximar a mídia / agarose. Isso permitirá que uma gota de células para aparecer na parte inferior da ponta da pipeta e tornar mais fácil para depositar as células.
2. Quando as células são depositadas, coloque o seguinte complexo para o queimador para permitir que o local de célula para secar - não mais de 20 seg.

Montagem do ensaio

1. Uma vez que o local de células secou, ​​alinhar o complexo slide / junta (a partir do passo 1) com a junta sobre a lamínula / junta / media / agarose / celular complexo (a partir do passo 13) e pressione suavemente para formar uma vedação.
   
   ETAPA CRÍTICA
2. Limpe as superfícies da lâmina e cobrir com um slip Kimwipe para remover os resíduos deixados pelo Parafilm. O ensaio completo deve se parecer com a Figura 1.
3. Coloque o complexo de slides concluída no palco aquecida mantida a 32 ° C (deslizar para baixo, cubra escorregar) imediatamente após limpar abaixo (passo 15) para evitar a condensação formando formulário. Se a condensação se formou, vamos sentar complexa de slides no palco aquecida durante alguns segundos antes de iniciar o software de aquisição de imagem.
4. Escolha o objetivo apropriado (2X, 4X ou 10X).

Parte 5: Preparação Filme

1. Ligue a câmera e microscópio, e verificar os níveis de luz (certifique-se a luz não é muito intensa). Inicie o computador e abra o programa de aquisição de imagem.
2. Clique na janela de imagem ao vivo e foco do microscópio. A imagem deve ser semelhante ao observado na Figura 3. Observe a superfície do ágar uniforme.
3. Começar a adquirir as imagens.
   
   ETAPA CRÍTICA
4. Verifique regularmente o foco durante a primeira hora, como a mídia / agar tende a resolver fazendo com que o foco para drift.
5. Limpar a área de trabalho.
6. Uma vez que a aquisição da imagem está completa, transferir as imagens adquiridas para o armazenamento e quebrar o complexo slide por imersão em etanol 90% durante a noite.
7. Juntas autoclave para reutilização.

Figura 1. Ilustração dos desenhos animados do complexo placa TM. (A) mostra a complexa placa básica TM em vista explodida e seção transversal. (B) mostra o uso de juntas maiores.

Figura 2. Aglomerado de Microscopia. Cada nó microscópio (inset) consiste de um microscópio Nikon E400, objetivos, uma fase aquecida, uma câmera Insight, e um computador notebook. Cada nó é interligados em rede e ligados a um computador do controlador mestre. Dois dos nodos são criados com recursos de fluorescência, que consiste da fonte de luz e duas persianas EXFO Uniblitz.

Figura 3. Uma imagem de 20X de aparelhos de ensaio de monitoramento em tempo = 0. Barra de escala, 1 mm.

Figura 4. Adaptabilidade do complexo placa TM. (A) uma imagem de 100X de M. xanthus deslizando sobre motilidade CTTYE em ágar 1,0%. (B) uma imagem de 20X de P. aeruginosa twitching motilidade. (C) uma imagem de S. 20X marcescens swarming motilidade. Ambos (B) e (C) foram testadas em LB em ágar 1,0%. (D) uma imagem de 40X de M. smegmatis deslizante motilidade em ágar LB em 0,5%. Esta imagem foi capturada usando a configuração de ensaio alternativos visto na Figura 1B.

Vídeo 1. Um vídeo time-lapse de um enxame submetido ao ensaio de monitoramento.

Video 2. Um vídeo time-lapse de um M. xanthus enxame onde 1% das células são fluorescente etiquetado. Alternando imagens de contraste de fase e fluorescentes foram capturados e sobrepostos para elucidar a posição de células fluorescentes dentro do enxame. Este vídeo foi capturado em CTTYE em ágar 1,0%.

Vídeo 3. Um vídeo de lapso de tempo de M. xanthus motilidade deslizamento. Este vídeo foi capturado em CTTYE em ágar 1,0%.

Video 4. Um vídeo de lapso de tempo de P. aeruginosa twitching motilidade. Este vídeo foi capturado em LB em ágar 1,0%.

Video 5. Um vídeo de lapso de tempo de S. marcescens swarming motilidade. Este vídeo foi capturado em LB em ágar 1,0%.

Video 6. Um vídeo de lapso de tempo de M. smegmatis deslizante motilidade. Este vídeo foi capturado em LB em ágar 0,5% utilizando a configuração do ensaio alternativa visto na Figura 1B.

Lapso de tempo microcinematography (TM) tornou-se uma abordagem padrão para estudar a motilidade procarióticas ^2-7. Tradicionalmente, a TM é realizado usando mechas de papel de filtro, pastilhas de ágar fina, ou placas de ágar como substrato ^8-11. Estes métodos são adequados e de custo eficaz quando usado para gerar seqüências de imagens para ilustrações geral do movimento bacteriano. No entanto, se seqüências de imagens deve resultar na geração de dados reprodutíveis e quantitativamente rigoroso, esses métodos são demorados e pouco fiáveis. Por exemplo, variações destas técnicas causados ​​por erro humano poderiam levar a uma ampla gama de imprecisões, de irregularidades na superfície do ágar que poderia afetar drasticamente o comportamento das bactérias em estudo para as diferenças no plano focal de um lado do substrato de ensaio para o outro. Para resolver estes problemas, criamos um complexo placa TM que é de qualidade suficientemente consistentes para produzir resultados reproduzíveis através do emprego de juntas de silicone que são baratos e reutilizáveis ​​(Fig. 1). Além disso, o complexo placa é altamente modificáveis ​​e provou para se manter hidratado e suficientemente oxigenado por mais de uma semana sobre uma variedade de tipos de mídia e as concentrações de ágar.

Para facilitar a geração de filmes time-lapse, 8 Nikon E400 microscópios foram equipados com os objetivos 2X, 4X, 10X e cada um. Além disso, uma câmera Insight (Diagnostic Instruments, Inc.), e uma fase aquecida (20/20 Technologies) foi adquirida por cada microscópio. Cada câmera estava ligada a um computador portátil em que a imagem altamente modificáveis ​​SPOT software de aquisição (Diagnostic Instruments, Inc.) tinha sido instalado. Todos os componentes foram montados em vários nós, cada um consistindo de um microscópio, três objectivos, uma câmera Insight, uma fase aquecida, e um computador de controle. Cada um dos oito nós foram interligados em rede em um cluster e ligado a um computador de armazenamento que é usado para compilar, analisar e armazenar os vídeos de lapso de tempo gerada pelo cluster (Fig. 2). O computador de armazenamento foi equipado com um sistema RAID 1 terabyte, o que é necessário para armazenar a grande quantidade de dados gerados pelo cluster.

Uma vez completo, o complexo de placas é colocado no palco aquecida do microscópio e ensaio de rastreamento é iniciado. Imagens são adquiridas em intervalos pré-definidos que são determinados com base na taxa de motilidade das células. Por exemplo, individual M. células xanthus move a uma taxa de aproximadamente um comprimento celular por minuto. Se as imagens são adquiridas de um M. xanthus enxame naquela mesma taxa (uma imagem por minuto), o que resulta de vídeo lapso de tempo irá aparecer suave durante a reprodução. Uma vez que a aquisição de imagens estiver concluída, as imagens são compilados em uma matriz seqüencial e reproduzido a uma taxa suficiente de que eles parecem estar se movendo (Video. 1). Este vídeo lapso de tempo podem agora ser analisados ​​usando uma variedade de pacotes de software.

Variações sobre Ensaio. O complexo placa TM é altamente modificável e pode ser usado para visualizar diversos microorganismos sob uma variedade de condições. Enxame de visualização pode ser realizada usando microscopia de contraste de fase (que registra o comportamento do enxame como uma única entidade), microscopia de fluorescência (que registra o comportamento de células individuais fluorescentes que foram diluídos em uma população não-fluorescente), ou uma combinação de ambos (que sobrepõe alternância seqüencial de contraste de fase e fluorescentes imagens) (Video 2). O complexo placa foi utilizado com sucesso para gerar lapso de tempo vídeos de vários comportamentos procarióticas incluindo M. xanthus motilidade delta, Pseudomonas aeruginosa motilidade espasmos, marcescens Seratia swarming motilidade, ea novela Mycobacterium smegmatis motilidade deslizante (Fig. 4 e Vídeos 3-6).