Inspelning flercelliga Beteende i Myxococcus Xanthus Biofilmer med Time-lapse Microcinematography

Förbrukningsmaterial som behövs:

• Klett meter
• Pipett och tips
• 2,5 ml mikrocentrifugrör
• Mikrocentrifug
• CTTYE media:
  • 1,0% Casitone (Difco Laboratories), 0,5% jästextrakt (Difco laboratorier),
  • 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mm KH ₂ PO _4, 8,0 mm MgSO ₄
• TPM media:
  • 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mm KH ₂ PO _4, 8,0 mm MgSO ₄
• Agarosen
• Vattenbad inställt pÃ¥ 55 ° C
• Glas objektglas
• Stort glas täckglas
• 2 x 2 cm, 0,5 mm tjock silikongummi packning (Grace Bio-Lab Inc.)
• Parafilm (eller märkning band)
• TÃ¥ng
• SmÃ¥ bindemedel klipp
• Micro-provtagning pipett (Fisher)
• 100 l glas engÃ¥ngsspets (Fisher)
• Kimwipes

Del 1: cellberedningen

Börja med att skapa en steril miljö.

• Ren arbetsplats, Don handskar och ljus brännare.

1. Starta en övernattning kultur av celler genom inokulering i en kolv som innehåller CTTYE buljong och inkuberas i mörker vid 32 ° C med kraftiga virvlar.
2. När kulturen nÃ¥tt en täthet av 5 x 10 ⁸ celler / ml pipett 1 ml celler i ett 2,5 ml mikrocentrifugrör.
3. Pellets cellerna genom centrifugering i 2 min på 16.000 xg (eller max hastighet).
4. Dekantera och kasta bort supernatanten.
5. Tvätta cellpelleten med 1 ml TPM (salt-balanserad, näringsrik fria medier).
   • Ã¥tersuspendera och vortex
6. Re-pellets celler genom att snurra i 2 min på 16.000 xg (eller max hastighet).
7. Dekantera och kasta bort supernatanten.
   
   Kritiskt steg
   
   
8. Helt återsuspendera pelleten i 100 l TPM medier med en kombination av pipettering och vortexa.
   
   VIKTIGT: Detta steg gör att det inte finns några klumpar av celler kvar i röret. Detta kan ta en stund.
9. Ställ cellerna undan i rumstemperatur medan du förbereder spårning analysen plattorna.

Del 2: Agar Förberedelser

1. Förbered 50 ml av både TPM (analys media) och CTTYE (närande disk) media.
2. Tillsätt 0,5 g agaros till varje (agaros är mindre diffraktiva än agar).
3. Autoklav för att sterilisera.
4. Efter sterilisering, underhålla media vid 55 ° C i en inkubator (eller vattenbad) medan byggandet av spårning komplex analys plattan.

Del 3: Nutritive Disk Construction

1. Placera en steril 0,5 mm tjock packning silikongummi på toppen av en flamma steriliserat glas objektglas, bildar en liten väl.
2. Pipettera ~ 300 ìl av 55 ° C CTTYE media / agaros i den skapade bra med packningen på bilden och innehåller närande disken. Den CTTYE media / agaros bör högen upp.
3. Placera en flamma steriliserad bild (utan packning) på toppen av CTTYE media / agaros.
   
   VIKTIGT: Denna bild måste ställas in ner i en vinkel för att förhindra att bubblor bildas.
4. När bilden är på plats, klämma komplexet tillsammans med mini bindemedel klipp - ett på varje sida.
5. Placera klippt komplexet vid 4 ° C och låt CTTYE media / agaros att ställa in. Det tar vanligtvis ca 5 min.

Del 4: Tracking-analys Förberedelser - inrätta tavla Complexes

Montera komponenterna, förbereda bilden komplex, placera närande disken, häll TPM media / agaros, separat och torr komplex tallrik, celler platta, och montera spåra komplex analys plattan.

Montera plattan komplexa komponenter

1. För varje komplexa, låga steriliseras en bild glas mikroskop
2. Placera en autoklaveras packning ovanpå bilden och ställ åt sidan (steriliserad uppåt). Detta kommer att utgöra botten av analysen.
3. Flamsterilisera en glaskupa slip och placera den på toppen av ett andra glas objektsglas lindade med märkning band (eller Parafilm) och ställ åt sidan (steriliserad uppåt). Detta används som ett stöd för bild för att hålla täckglaset från sprickbildning. Detta kommer att utgöra toppen av analysen.
4. Flamsterilisera tredjedel bild glas mikroskop och ställ åt sidan (steriliserad uppåt). Detta kommer att användas för att platta till agaros.
   
   VIKTIGT: Kontrollera att packningarna bilda en tätning med glaset genom att trycka ner den med pincett, annars media / agarosen kan torka ut.

P spetsar närande disk

VIKTIGT: steg 5 till 10 måste göras för att en bild komplexa i taget, annars media / agarosen kunde börja stelna resulterar i dålig filmkvalitet.

5. Ta bort de näringsmässiga disken komplex form 4 ° C (steg 5 från del 3) och bända isär bilderna utsätta nu stelnat CTTYE / agaros.
6. Ta en 1 mm i diameter "närande disk" från CTTYE media / agaros väl beskrivna ovan med hjälp av en mikro-sampling pipett med en 100 l glas engångsspets och placera den i det skapade väl av packningen på locket slip (steg 3 ovan) .

Häll ut på plattor

Kritiskt steg

7. Pipettera ~ 300 ìl av 55 ° C TPM media / agaros i den skapade väl av packningen på locket halka och innehåller närande disken. TPM media / agaros bör högen upp.
   
   Kritiskt steg
8. Placera lågan steriliserade bilden utan packning (från steg 3) på toppen av TPM media / agaros.
   
   VIKTIGT: Denna bild måste ställas in ner i en vinkel för att förhindra att bubblor bildas.
   
   
9. När bilden (från steg 5) är på plats, klämma komplexet tillsammans med mini bindemedel klipp - ett på varje sida.
10. Placera klippt komplexet vid 4 ° C och låt media / agarosen att ställa in. Det tar vanligtvis ca 5 min.

Separata och torra plattor

VIKTIGT: För att förhindra att media / agarosen torkar ut, steg 11 till 20 endast bör utföras på en bild komplex i taget.

VIKTIGT: För bästa resultat steg 11 till 13 ska utföras vid 4 ° C.

11. När media / agaros har satt, ta bort bindemedel klipp och pressa i slutet av komplexa att lossa på tejpen förpackade bild.
12. Ta bort tejpen förpackade bild och placera den på bänken för vidare användning.
    
    Kritiskt steg
13. Använd pincett som en kil, separat locket slip / packning / media / agarosen komplex från stöd bilden (utan packning) och kasta stöd bild.
    
    VIKTIGT: Använd inte en snokande rörelse för att skilja täcka slip / packning komplex. Detta kan resultera i locket glida bryta och / eller media / agarosen hålla sig till stöd för bilden.
14. Placera locket slip / packning / media / agarosen komplex på bandet förpackade slide (packning uppåt) och ta bort från 4 ° C. Placera denna komplexa bredvid en brännare så att alla synliga fukt avdunsta från den nyligen exponerade media / agaros yta - inte mer än 1 min.
    
    VIKTIGT: Låt inte media / agarosen torr för länge eftersom det kan påverka M. Xanthus svärm beteende.

Plate celler

Kritiskt steg

1. När fukt har avdunstat, pipett 0,5 l av den koncentrerade celler (steg 8 från del 1) på Media / agarosen ungefär 1 mm från näringsämnen disken.
   
   VIKTIGT: Det är oerhört viktigt att se till att de celler deponeras genom att flytta pipetten rakt ner och sedan rakt upp. Detta säkerställer att svärmen blir cirkulär.
   
   VIKTIGT: Det är oerhört viktigt att inte röra pipettspetsen till media / agarosen. Detta kommer att göra en fördjupning på ytan och ändra beteendet hos M. Xanthus svärm.
   
   TIPS: Tryck ned pipettspetsen före närmar media / agarosen. Detta kommer att möjliggöra en minskning av celler ska visas på botten av pipettspetsen och göra det lättare att deponera cellerna.
2. När celler deponeras, placera den komplexa bredvid brännaren så att cellen plats att torka - inte mer än 20 sek.

Montera analys

1. När cellen plats har torkat, justera bilden / packningen komplex (från steg 1) med packningen på locket slip / packning / media / agaros / cell komplex (från steg 13) och tryck försiktigt ihop till en säl.
   
   Kritiskt steg
2. Rengör ytorna på bilden och täcker halka med en Kimwipe att ta bort rest från Parafilm. Den färdiga analysen bör likna Figur 1.
3. Placera den färdiga bilden komplex på den uppvärmda scenen hålls vid 32 ° C (glida ner, locket glida upp) omedelbart efter torka (steg 15) för att förhindra att kondens bildas bildas. Om kondens har bildats, låt glida komplexa sitta på den uppvärmda scenen i flera sekunder innan programvaran bilden förvärvet.
4. Välj lämpligt mål (2X, 4X eller 10X).

Del 5: Film Förberedelser

1. Slå på kameran och mikroskop och kontrollera ljusnivåer (se till att ljuset inte är för hård). Starta datorn och öppna programmet bilden förvärvet.
2. Klicka på bilden på bildskärmen fönstret och fokusera mikroskopet. Bilden ska visas som liknar den som ses i figur 3. Observera den enhetliga agarytan.
3. Starta hämta bilder.
   
   Kritiskt steg
4. Kontrollera fokus regelbundet under den första timmen, som media / agar tenderar att bosätta sig orsakar fokus att glida.
5. Rengör arbetsområdet.
6. När bilden förvärvet är klar förvärvas överföra bilder för lagring och bryta ner bilden komplex genom att blötlägga i 90% etanol över en natt.
7. Autoklav packningar för återanvändning.

Figur 1. Tecknad illustration av TM plattan komplex. (A) visar den grundläggande TM plattan komplex i sprängskiss och tvärsnitt. (B) visar användningen av stora packningar.

Figur 2. Mikroskop kluster. Varje mikroskop nod (infälld) består av en Nikon E400 mikroskop, mål, en uppvärmd skede en Insight kamera och en bärbar dator. Varje nod är ett nätverk tillsammans och kopplas till en mästare controller dator. Två av noderna är konfigurerade med fluorescens funktioner som består av EXFO ljuskällan och två fönsterluckor Uniblitz.

Figur 3. 20x bild av spårning analysens apparater vid tiden = 0. Skala bar, 1 mm.

Figur 4. Anpassningsförmåga av TM plattan komplex. (A) en 100X bild av M. Xanthus glida motilitet på CTTYE hos 1,0% agar. (B) en 20X bild av P. aeruginosa ryckningar motilitet. (C) en 20X bild S. marcescens myllrande motilitet. Både (B) och (C) analyserades på LB på 1,0% agar. (D) en 40X bild av M. smegmatis glidande motilitet på LB i 0,5% agar. Denna bild togs den alternativa analysen konfiguration ses i figur 1B.

Video 1. En time-lapse video av en svärm utsätts för spårning analysen.

Video 2. En time-lapse video av en M. Xanthus svärm där 1% av cellerna är fluorescerande. Alternerande faskontrast och fluorescerande bilder fångades och överdrog att belysa situationen för fluorescerande celler i svärmen. Denna video fångades på CTTYE hos 1,0% agar.

Video 3. En time-lapse video av M. Xanthus segelflygning motilitet. Denna video fångades på CTTYE hos 1,0% agar.

Video 4. En time-lapse video av P. aeruginosa ryckningar motilitet. Denna video fångades på LB på 1,0% agar.

Video 5. En time-lapse video av S. marcescens myllrande motilitet. Denna video fångades på LB på 1,0% agar.

Video-6. En time-lapse video av M. smegmatis glidande motilitet. Denna video fångades på LB hos 0,5% agar den alternativa analysen konfiguration ses i figur 1B.

Time-lapse microcinematography (TM) har blivit en standardiserad metod för att studera prokaryota motilitet ^2-7. Traditionellt är TM utförs med hjälp av filterpapper vekar, tunna kuddar agar, eller plattor agar som substrat ^8-11. Dessa metoder är lämpliga och kostnadseffektiva när det används för att generera bildsekvenser för allmän illustrationer av bakteriell rörelse. Men om bildsekvenser måste resultera i uppkomsten av reproducerbar och kvantitativt rigorösa data, dessa metoder är tidskrävande och inte helt tillförlitliga. Till exempel kan variationer i dessa tekniker som orsakas av mänskliga misstag leder till ett brett utbud av felaktigheter, från oegentligheter i agarytan som dramatiskt kan påverka beteendet hos de bakterier som studeras på skillnader i fokalplanet från ena sidan av analysen substrat till den andra. För att lösa dessa problem har vi utformat en TM tallrik komplex som är av tillräckligt jämn kvalitet för att ge reproducerbara resultat genom att använda silikon packningar som är både billiga och kan återanvändas (bild 1). Dessutom är plattan komplex mycket förändras och har visat att stanna hydrerade och tillräckligt syresatt för mer än en vecka över en mängd olika medietyper och koncentrationer agar.

För att underlätta genereringen av tidsförlopp filmer var 8 Nikon E400 mikroskop utrustad med 2X, 4X och 10X mål vardera. Dessutom har en Insight kamera (Diagnostic Instruments, Inc.), och en uppvärmd stadium (20/20 Technologies) förvärvats för varje mikroskop. Varje kamera var kopplad till en bärbar dator där den mycket modifierbara bilden förvärvet programvara SPOT (Diagnostic Instruments, Inc.) hade installerats. Alla de olika komponenterna ihop till noder, vardera bestående av ett mikroskop, tre mål, en Insight kamera, en uppvärmd scen och en kontrollerande dator. Var och en av åtta noder var nätverket samman till ett kluster och kopplad till en lagring dator som används för att sammanställa, analysera och lagra tidsförlopp videor genereras av klustret (Fig. 2). Lagring dator var utrustad med en 1 terabyte RAID-system, som behövs för att lagra stora mängder data som genereras av klustret.

När du är klar, är plattan komplex placeras på den uppvärmda skede av mikroskop och spårning analys initieras. Bilderna förvärvas vid förinställda intervaller som bestäms utifrån den motilitet graden av cellerna. Till exempel enskilda M. Xanthus celler rör sig med en hastighet av ungefär en cell längd per minut. Om bilder förvärvas av en M. Xanthus svärm vid samma takt (en bild per minut), kommer den resulterande tidsförlopp video visas slät under uppspelning. När bilden förvärvet är klar är bilderna sammanställs i en sekventiell matris och spelas upp i tillräcklig mängd att de verkar vara på väg (Video. 1). Denna gång-lapse video kan nu analyseras med hjälp av ett paket mängd programvara.

Variationer på analys. TM plattan komplexet är mycket förändras och kan användas för att visualisera många olika mikroorganismer under olika förhållanden. Swarm visualisering kan utföras med faskontrast mikroskopi (som registrerar beteende svärm som en enda enhet), fluorescensmikroskopi (som registrerar hur enskilda fluorescerande celler som har spätts ut i en icke-fluorescerande befolkning), eller en kombination av båda (som överlägg alternerande sekventiell faskontrast och fluorescerande bilder) (video 2). Plattan komplex har använts för att framgångsrikt generera tidsförlopp videor av flera prokaryot beteenden inklusive M. Xanthus segelflygning motilitet, Pseudomonas aeruginosa ryckningar motilitet, Seratia marcescens myllrande motilitet, och romanen Mycobacterium smegmatis glidande motilitet (bild 4 och videor 3-6).