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 JoVE Biology

Método para o isolamento de Francisella tularensis Membranas externas

1, 1, 1

1Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

Article
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    Summary

    Um protocolo para a separação de membranas internas e externas da

    Date Published: 6/29/2010, Issue 40; doi: 10.3791/2044

    Cite this Article

    Huntley, J. F., Robertson, G. T., Norgard, M. V. Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes. J. Vis. Exp. (40), e2044, doi:10.3791/2044 (2010).

    Abstract

    Francisella tularensis é um cocobacilo Gram-negativos intracelulares eo agente causador da tularemia zoonose. Quando comparado com outros patógenos bacterianos, a dose infecciosa extremamente baixa (<10 UFC), progressão rápida da doença, e alta morbidade e mortalidade sugerem que as cepas virulentas de Francisella codificam para fatores de virulência da novela. Superfície exposta moléculas, proteínas da membrana externa ou seja (OMPs), foram mostrados para promover a célula hospedeira bacteriana de ligação, de entrada, a sobrevivência intracelular, virulência e evasão imune. A relevância para o estudo de OMPs é ainda mais enfatizada pelo fato de que eles podem servir como vacinas de proteção contra uma série de doenças bacterianas. Considerando OMPs pode ser extraído de bactérias gram-negativas através de técnicas de extração em massa de membrana, incluindo sonicação de células seguida de centrifugação e / ou extração de detergente, estas preparações são freqüentemente contaminados com periplasmic e / ou citoplasmática (interna) de membrana (IM) contaminantes. Durante anos, o "padrão ouro" método para a separação bioquímicos e biofísicos de bactérias gram-negativas IM e membranas externas (OM) tem sido a de bactérias sujeitas à lise osmótica e spheroplasting, seguido por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Uma vez mergulhado em um gradiente de sacarose, OM pode ser separado de mensagens instantâneas com base nas diferenças em densidade de flutuação, acredita-se ser baseada em grande parte, a presença de lipopolissacarídeo (LPS) na OM. Aqui, descrevemos um método rigoroso e otimizados para extrair, enriquecer, e isolar F. tularensis membranas externas e seus associados OMPs.

    Protocol

    Dia 1: F. tularensis inoculação placa

    1. Culturas prato congelado estoque de F. tularensis em Mueller-Hinton suplementado com 2,5% (vol / vol) de doadores soro bovino, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (wt / vol), glicose e 0,025% (wt / vol) pirofosfato de ferro. Crescer F. tularensis a 37 ° C com 5% de CO 2 por aproximadamente 24 h.

    Dia 2: F. líquido tularensis inoculação media

    1. Preparar e autoclave 1 litro de meio-cação ajustada Mueller-Hinton (contendo 1,23 mM cloreto de cálcio dihidratado e 1,03 mM de cloreto de magnésio hexa-hidratado). Quando resfriado a 37 ° C, médio complementar ainda mais com glicose a 0,1% (wt / vol), pirofosfato de ferro de 0,025% (wt / vol), e 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filtro de esterilizar (0,22 μ) médio em duas alíquotas de 500 ml.
    2. Retire 12 ml de meio suplementado Mueller-Hinton e transferir para um tubo estéril Falcon de 50 ml.
    3. Usando um loop de inoculação estéril de 10 mL, raspar uma loopful grande de F. tularensis crescimento de placas de ágar (a partir de dia 1) e bactérias transferência em 12 ml de Mueller-Hinton médio (ver Etapa 2). Vezes solução pipeta múltiplos break-up aglomerações e preparar suspensão bacteriana homogênea. Não vortex.
    4. Usando uma pipeta estéril, inocular cada navio de 500 ml com 5 ml de suspensão bacteriana a partir da Etapa 3. Crescer culturas caldo a 37 ° C por 14 a 18 h com agitação suave (190-200 rpm em um New Brunswick Innova série 2300 shaker).

    Dia 3: lise, Spheroplasting osmótica, sacarose e centrifugação em gradiente de densidade

    1. Obter F. culturas tularensis da incubadora agitação e retire uma alíquota de 1 ml de cada cultura de 500 ml para verificar as densidades ópticas respectivos. Nós descobrimos que a extração de membrana ideal e resultados de isolamento quando se utiliza F. tularensis células em fase logarítmica iniciais de crescimento, que se correlaciona com uma OD 600 entre 0,2-0,4 (~ 10 julho - 10 agosto UFC / ml). Culturas com uma 600 OD inferior a 0,2 não renderá quantidade suficiente de material da membrana total para gradientes de sacarose subseqüentes. Por outro lado, culturas com uma 600 OD superior a 0,4 (se aproximando da fase estacionária) foram encontrados para o rendimento misto membrana fusões.
    2. Centrífuga culturas em 7.500 x g por 30 min a 15 ° C para coletar as células. Recomendamos a centrifugação das culturas em quatro garrafas de 250 ml de centrífuga, porque facilita suspensão pellet subseqüentes.
    3. Remova cuidadosamente o sobrenadante de mídia de cada frasco de centrífuga e bata as garrafas em papel absorvente para remover excesso de meio de crescimento.
    4. Dentro de 10 min após a conclusão de centrifugação, suspender cada pellet bacteriano em 8,75 ml de sacarose 0,75 M (em 5 mM Tris, pH 7,5). Todos os quatro pellets bacteriana deve ser suspenso e transferido (35 total de ml de suspensão bacteriana) para um balão de 250 ml estéril (com uma pequena stirbar) dentro de 10 min.
    5. Enquanto suavemente a mistura da suspensão de células em um stirplate, lentamente, adicione 70 ml (2 volumes), de 10 mM EDTA dissódico (em 5 mM Tris, pH 7.8) ao longo de 10 min. Adicionar a solução de EDTA com a ponta da pipeta abaixo do nível de suspensão de células para evitar elevadas concentrações locais de EDTA. O stirbar deve ser girando a uma taxa suficiente para misturar a suspensão da célula, mas não rápido o suficiente para causar espuma ou formação de bolhas. Após a solução de EDTA foi adicionado, incubar a solução por 30 min em temperatura ambiente.
    6. Após a incubação de 30 minutos, lentamente, adicione 11 ml (1 / 10 º volume) de uma solução de lisozima 2 mg / ml a uma concentração final de 200 mg / ml. Continue a misturar a suspensão de células durante a adição de solução de lisozima. Como observado acima, adicionar a solução de lisozima com a ponta da pipeta abaixo do nível de fluido celular suspensão para evitar concentrações elevadas de locais de lisozima. Ações lisozima soluções (2 mg / ml) podem ser preparados em single-use alíquotas e armazenadas a -20 ° C durante três a quatro meses. Incubar a solução resultante por 30 min em temperatura ambiente.
    7. Durante a incubação de 30 minutos, prepare um frasco estéril 1L com um pequeno stirbar e 530 ml de temperatura ambiente Cellgro Molecular Grade dH 2 O (4,5 volumes).
    8. Lisar osmoticamente suspensão de células (a partir da Etapa 6) por diluição lenta (caudal de aproximadamente 11 ml / min) em 530 ml de dH Molecular Grade 2 O (a partir da Etapa 7) ao longo de 10 a 15 min com a mistura suave. Por causa do maior volume de solução nessa etapa, aumentar a velocidade stirbar para assegurar a mistura adequada. O stirbar deve ser girando a uma taxa suficiente para dispersar completamente a suspensão de células, uma vez adicionado ao 2 dH O, mas não rápido o suficiente para levar à formação de espuma ou formação de bolhas. Adicione a suspensão de células com a ponta da pipeta descansando no fundo do frasco, ao lado do stirbar, para facilitar a diluição uniforme do cell de suspensão. Descobrimos que 25 ml-pipetas melhor trabalho durante esta etapa. Acompanhar atentamente o processo de diluição e interromper o fluxo necessário para dispersar acumulações locais de células, aglomerados de células, e tufos de células. Incubar a solução resultante por 30 min em temperatura ambiente. Note que este passo parece ser um dos mais desafiadores e críticos para o sucesso geral do experimento.
    9. Após a incubação de 30 min, a transferência de 40 alíquotas ml da solução de lise osmótica em 50 ml tubos cônicos e centrifugar a 7500 xg por 30 min a 10 ° C para remover as células intactas e detritos.
    10. Após a centrifugação, remover cuidadosamente 27-30 ml do sobrenadante de cada tubo cônico e sobrenadantes piscina em um frasco estéril 1L
    11. Transferir 25 ml do sobrenadante em pool, cada, em 16 tubos de ultracentrífuga e centrifugar a 200.000 x g (44.400 rpm em rotor F50L-8x39 ultracentrífuga FiberLite) por 2 horas a 4 ° C. Note que cada rotor detém 8 tubos, de modo que este passo requer dois rotores e duas ultracentrífugas. Alternativamente, o segundo conjunto de 8 tubos devem ser mantidos a 4 ° C até centrifugado.
    12. Dentro de 10 min do fim do percurso de ultracentrífuga, prepare modificada tampão de ressuspensão de membrana. Transferência de 8 ml de tampão de suspensão de membrana (25% [wt / wt] sacarose, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) para um tubo estéril e adicionar 1 comprimido de EDTA-free cocktail inibidor da protease e 375 U de Benzonase. Delicadamente misturar a solução para dissolver comprimido inibidor da protease.
    13. Após ultracentrifugação, cuidadosamente despeje sobrenadantes, inverter os tubos ultracentrífuga em material absorvente, e bata tubos para remover excesso de sobrenadante. Marca a localização de cada pellet de membrana com um marcador para ajudar na visualização. Delicadamente ressuspender oito pellets de membrana com 600 mL cada um tampão modificado membrana ressuspensão. Transferir cada ressuspensão de membrana para o próximo conjunto de oito tubos, delicadamente ressuspender estes oito pellets, eo pool de resuspensions membrana, resultando em um tubo estéril. As membranas são difíceis peletizada para voltar a suspender, por isso continuar passando o buffer ressuspensão modificado membrana sobre a pelota até que as cascas de distância da parede do tubo. Muitas vezes é necessário usar a ponta micropipeta para raspar o pellet membrana fora da parede do tubo e ajuda no processo de ressuspensão. Quando pipetagem, evitar formação de espuma ou formação de bolhas. Note que este passo parece ser um dos mais desafiadores e críticos para o sucesso geral do experimento.
    14. Quando a membrana de pellets foram ressuspendidos e removidos todos os 16 tubos, lavar todos os quatro tubos com 600 mL de tampão modificado membrana ressuspensão. A lavagem deve ser centrada em torno da área marcada (membrana pellet) de cada tubo. Transferência da lavagem para o tubo de ressuspensão de membrana. Repita a etapa de lavagem para os restantes três conjuntos de quatro tubos.
    15. Incubar a membrana com a ressuspensão de balanço suave durante 30 min à temperatura ambiente para se degradar DNA e ajuda na redução de material floculantes.
    16. Remover uma pequena alíquota da suspensão de membrana e realizar a quantificação de proteína de membrana para determinação do rendimento total. Normalmente, preparar puro, 1:1, diluída (em 2,5% SDS), e 1:3 diluído (em 2,5% SDS) amostras de membrana, o calor as amostras a 90 ° C por 10 min, e usar o ensaio de proteína BioRad DC para quantificar a concentração de proteína de membrana ressuspensão. Produção de proteína total é, geralmente, entre 1,0 mg / ml e 1,6 mg / ml. O uso de calor e SDS são obrigados a liberar OMPs das membranas extraídas de forma que um valor de quantificação mais precisa da proteína pode ser obtida.
    17. Prepare gradientes de sacarose linear por camadas 1,8 ml cada uma das soluções de sacarose (wt / wt, preparado em 5 mM EDTA, pH 7,5) em 14 x 95 mm tubos de Ultra-Clear ultracentrífuga na seguinte ordem: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Camadas de gradientes de sacarose é mais fácil de realizar quando se utiliza um bulbo de pipetador, não uma pipeta automática.
    18. Com base na quantificação de proteínas da membrana ressuspensão (Passo 16), a camada de 1,5 mg de ressuspensão de membrana no topo de cada gradiente. A cada 14 x 95 milímetros tubo de ultracentrífuga tem uma capacidade máxima de 12,5 ml e, dado que 10,8 ml é contabilizado pelas soluções de sacarose a partir do Passo 17, você não deve carregar mais de 1,7 ml de ressuspensão de membrana por gradiente. Individualmente e pesar cuidadosamente ajustar o peso final de cada tubo gradiente de sacarose (adicionando ou removendo a ressuspensão de membrana), para que todos os tubos o mesmo peso (± 0,01 g).
    19. Transferência de gradientes de sacarose em um balde de rotor SW-40Ti balançando e centrifugar a 256.000 x g (38.000 rpm) por um período mínimo de 17 horas a 4 ° C.

    Dia 4: Coleta de frações gradiente de sacarose

    1. Após 17 h de centrifugação, parar o processo de centrifugação, e remova cuidadosamente gradientes de sacarose a partir do rotor SW-40Ti.
    2. Limpar cuidadosamente o fundo do tubo de gradiente de sacarose com etanol 70%, perfurar afundo do tubo com uma agulha de 21G, e recolher seqüencial 500 mL frações do gradiente em tubos de microcentrífuga estéril. Repita o procedimento para gradientes subseqüentes. O gradiente deve ser a escorrer por fluxo de gravidade, de modo a não perturbar o gradiente de sacarose. No entanto, se o gotejamento cessa a partir do fundo do tubo de gradiente, uma pequena quantidade de pressão pode ser aplicada ao topo do tubo com o dedo.
    3. Determinar o índice de refração de cada fração gradiente de sacarose utilizando um refratômetro e correlacionar o índice de refração com uma densidade específica em g / ml 1. Avaliar a localização de proteínas através da preparação de frações de sacarose representante gradiente (incrementos de densidade de 0,01; de 1,11 g / ml a 1,26 g / ml) para SDS-PAGE de separação, a transferência para nitrocelulose, e immunoblotting

    Resultados representante

    Quando realizada corretamente, este procedimento resulta na separação completa de IM e vesículas OM de ambos Tipo A Tipo (por exemplo, SchuS4) e B (por exemplo, LVS) das cepas de F. tularensis. Como mostrado na Immunoblots representante na Figura 1, F. OMPs tularensis localizar entre as densidades de 1,17 e 1,20 g / ml. Em comparação, PIM localizar entre as densidades de 1,13 e 1,14 g / ml.

    Figura 1
    Figura 1. Immunoblotting de F. tularensis gradientes de densidade de sacarose. Frações seqüenciais foram coletados a partir de gradientes e densidades (g / ml) foram calculados com base em índices de refração. Proteínas foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para nitrocelulose, e immunoblotted para detectar OMP e fracionamento IMP. mw, prestained padrões de peso molecular, com tamanhos (em kDa) observou, no lado esquerdo de cada blot. LVS, toda lisados ​​celulares de F. LVS tularensis. O correspondente fração sacarose densidades de gradiente são anotados acima de suas respectivas faixas. OMPs e PIM, como observado na margem esquerda, foram detectadas com anti-soros, policlonal monoespecífico. Resultados semelhantes foram obtidos para F. tularensis SchuS4.

    Discussion

    Este protocolo descreve uma variação da lise, spheroplasting osmótica, sacarose e gradiente de densidade centrifugação "padrão ouro" para a separação física e enriquecimento de bactérias Gram-negativas OMs bacteriana de outros componentes celulares 2, 3, 4. Considerando que anteriormente descrita a aplicação deste método para isolar OMs de ambos os tipos A e B Tipo de cepas de F. tularensis 5, esta apresentação oferece um procedimento mais detalhado e otimizado para o isolamento do OM. Na verdade, este é um avanço importante para a identificação de potenciais de superfície exposta e fatores de virulência deste patógeno presuntivo mortal. A importância deste procedimento foi demonstrada em estudos realizados por nosso laboratório mostram que a imunização de camundongos com OMPs purificada de uma protecção substancial contra virulenta Tipo A F. tularensis desafio pulmonar 6. Como observado acima fase de crescimento, das células bacterianas, monitoramento cuidadoso durante a lise osmótica, gentil e ressuspensão de pellets de membrana são passos críticos que parecem estar relacionados com o sucesso / fracasso deste processo de separação de membrana. Enquanto este método otimizado é rigoroso e sujeito a alguma variabilidade experimental, a OMs resultando parecem ser de qualidade notavelmente melhorada em comparação com aqueles obtida a partir do uso de detergentes, cloreto de lítio, carbonato de sódio ou 7, 8, 9, 10, 11, 12.

    Disclosures

    Não há conflitos de interesse declarados.

    Acknowledgements

    O projeto descrito foi apoiada pelo Grant Numbers P01 AI055637 e U54 AI057156 de NIAID / NIH. Seu conteúdo são da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial dos Programas de RCE Office, NIAID, ou NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Donor calf serum Mediatech, Inc. 35-022-CV
    IsoVitaleX BD Biosciences 211876
    Cellgro molecular grade dH2O Mediatech, Inc. 46-000-CM
    38.5 ml polycarbonate bottle FiberLite 010-0514
    F50L-8x39 ultracentrifuge rotor FiberLite 096-087051
    Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche Group 04693132001
    Benzonase Novagen, EMD Millipore 70664-3
    DC protein assay Bio-Rad 500-0116
    Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes Beckman Coulter Inc. 344060
    SW-40Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter Inc. 331301
    Abbe benchtop refractometer Fisher Scientific 13-964-10

    References

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