Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

1,2, 1

1Department of Systems Biology and Translational Medicine, College of Medicine, Cardiovascular Research Institute, Texas A&M Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 23.22.212.158, User IP: 23.22.212.158, User IP Hex: 387372190

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

Trache, A., Lim, S. Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (44), e2072, doi:10.3791/2072 (2010).

Abstract: תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

כדי להבין את המנגנון שבאמצעותו תאים חיים במובן כוחות מכניים, וכיצד הם מגיבים להסתגל לסביבה שלהם, טכנולוגיה חדשה מסוגלת לחקור התנהגות תאים ברמה המשנה הסלולר עם רזולוציה במרחב ובזמן גבוהה פותחה. לפיכך, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) היתה משולבת עם מיקרוסקופיה סך פנימית הקרינה (TIRF) השתקפות מהיר ספינינג דיסק (FSD) מיקרוסקופיה confocal. המערכת המשולבת הוא החלים רחב על פני מגוון רחב של מחקרים דינמי מולקולריים בתאים חיים כל חסיד, המאפשר הדמיה אופטית ישיר של תגובות התא לגירוי מכני בזמן אמת. התארגנות משמעותית של סיבי אקטין ו הידבקויות מוקד הוצגה עקב גירוי מכני מקומי על פני התא apical כי Induced שינויים לתוך המבנה התאי בגוף התא. אלו טכניקות חדשניות יספק מידע חדש להבנת השינוי המבני תא חי ואת הדינמיקה בתגובה לכוח מכני. פרוטוקול מפורט נתונים לקבוע כי נציג תא חי להראות בתגובה לגירוי מכני מוצגים.

Protocol: תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

1. סקירה כללית של מערכת מיקרוסקופ משולב

המערכת מיקרוסקופ המשמש במחקרים אלה תוארה בפירוט 1. בקצרה, הפוכה אולימפוס IX-81 מיקרוסקופ עם TIRF מצורף (אולימפוס, מרכז עמק, PA) בשילוב עם CSU-22 Yokogawa ראש סריקה (Yokogawa החשמל Inc, יפן). BioScope SZ מיקרוסקופ כוח אטומי (Veeco מכשירים Inc, סנטה ברברה, קליפורניה) הוא רכוב על גבי מיקרוסקופ אופטי הפוכה, ואת המערכת כולה מוצבת בחלק העליון של הטבלה מחקר כיתה אופטי (ניופורט, אירווין, קליפורניה).

האסיפה confocal מורכב מסורק דיסק-ספינינג, גלגל מסנן חיצוני המצלמה EMCCD שלה (רופר Scientific-Photometrics, טוסון, אריזונה) מחוברים נוקשה עם לוחית אלומיניום בסיס מושם על משטח סיליקון הכרחי דעיכת רטט. סורק confocal מתחבר עם המיקרוסקופ דרך מקורבות עם צווארון חתר שניתן decoupled מן המיקרוסקופ במהלך המדידות AFM, כך אין רעידות מהסורק דיסק ספינינג, ישפיע על מדידות AFM. ארגון, קריפטון לייזר (ספקטרה פיזיקה, Mountain View, CA) משמש כמקור עירור הן TIRF מצבי הדמיה confocal, והוא יכול להיות בשילוב לחילופין בשני סיבים אופטיים אשר לספק את לייזר המצורף TIRF או ראש סריקה, בהתאמה . שני המחשבים לשלוט במערכת: Slidebook תוכנה שולטת הדמיה אופטית ותוכנת Nanoscope שולט AFM.

2. תא תרבות

תאים חיים להביע GFP בונה ממוקד כנגד חלבונים ספציפיים צריך להיות ממוקם בתוך צלחת תחתית זכוכית תא תרבות 24 שעות לפני הניסוי גירוי מכני. ביום הניסוי להחליף את תרבית תאים בינוניים עם אדום בינוני ללא פנול. המנה תרבית תאים הוא רכוב על הבמה AFM עם קולר מגנטי.

3. AFM עצה הכנה מיקרוסקופ הקמה

קצה AFM אישית עם מיקרון 2 biotinilated חרוז זכוכית יהיה שטף חמש פעמים עם DPBS ואז מודגרות 5 דקות עם avidin (1 מ"ג / מ"ל), שטפתי שוב עם DPBS חמש פעמים, ולאחר מכן מודגרות 5 דקות עם biotinilated 1 מ"ג / מ"ל פיברונקטין. טיפ יהיה שטף חמש פעמים יותר בסוף 2, רכוב על הסורק AFM, ולאחר מכן את החצאית סיליקון מגן יוצבו סביב לבעל. הגדר את המיקרוסקופ לצפייה וידאו כדי ליישר את קצה AFM במרכז שדה הראייה. יישר את המנוף אופטי ידי הצבת את קרן הלייזר בסוף מאוד של שלוחה, ולאחר מכן לשנות את אובייקטיבי מטרה בהגדלה גבוהה המתאים הדמיה תא בודד. באביב קבוע של קצה חייב להיות נחוש לפני תחילת הניסוי. פרמטר זה תימדד בשיטת מנגינה תרמית זמין התוכנה Nanoscope. החלף ממצלמת וידאו אל המצלמה EMCCD כדי לאפשר הדמיה בתפרחת. לאחר מכן, בחר תא ולהביא את קצה AFM במגע עם תא ספציפי. לאחר זמן המתנה 20 דקות, אשר הוא הכרחי עבור הידבקות מוקד חזקה כדי ליצור בנקודת AFM של מגע עם פני התא, ההליך גירוי מכני יתחיל.

4. גירוי מכני של תא חי

TIRF הדמיה 3-4 תהיה שיטת הבחירה של הדמיה לכימות הידבקויות מוקד, ו-ספינינג דיסק confocal הדמיה 5 ישמש לדמיין את cytoskeleton אקטין בגוף התא. AFM 6 ישמשו הדמיה מצב הקשר תחת נוזל.

התמונה TIRF או confocal של התא יהיה רכשה לפני תחילת ההליך גירוי מכני. גירוי מכני יהיה המושרה על ידי החללית AFM פונקציונליות כי יועברו מעלה בשלבים בדידים כל 3-5 דקות במשך תקופה של זמן (1-1.5 שעות). התא מגיב תגובה תירשם ברציפות תוכנה Nanoscope כסדרה של תמונות גובה, כל שורה בתמונה המייצג יחידת זמן של 1 שניות. בעוד רכישת נתונים AFM, המפעיל צגים בכל עת את עמדת-z של קצה AFM, כדי לקבוע את התזמון הנכון בשביל למשוך הבא.

אחרי כל גירוי מכני ניתן לרכוש תמונה TIRF או confocal של התא Slidebook תוכנה, בעוד הרף רכישת נתונים AFM. התמונות אופטי יכול להיות מעובד off-line ליצור סרטים שמראים cytoskeleton אקטין מוקד מחדש הידבקויות. כמו כן, כל תמונה ניתן לעבד כמותי כדי לקבוע תא שטח, אזור חלבון מסוים, ולנתח את המורפולוגיה תא בכלל.

בסוף הניסוי קצה AFM היא נסוגה מהתא ורגישות AFM הטיפ תימדד בתוכנה Nanoscope.

הניסוי הוא מאוד רגיש לרעש! כל נגיעה לדבר או מיקרוסקופ במהלך לשעברperiment יש להימנע. כדי למזער את רעש המדידות AFM, confocal את הדיסק מסתובב, צריך להיות דה מצמידים של המיקרוסקופ. זמן ההמתנה כדי ליצור מוקדי הדבקה חזקה בין שטח פני התא ואת קצה AFM עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא המשמש ואת מצופה מטריצה ​​על קצה.

5. נציג תוצאות

איור 1
באיור 1. תא השריר החלק בכלי הדם אותו (VSMC) transfected עם אקטין mRFP vinculin ו-GFP היה צילמו על ידי: (א) AFM על פני התא apical; (ב) TIRF על פני השטח של התאים הבזליים, ו (ג) ספינינג דיסק מיקרוסקופיה confocal בגוף התא. התמונה confocal מוצג כהשלכה מרבי של מחסנית 3-D. חפיפה טובה בין AFM ו TIRF או ספינינג דיסק תמונות confocal מוצגים (ד) ו - (ה), בהתאמה. גודל התמונה הוא 64 x 50 מיקרון.

איור 2
איור 2. VSMC transfected עם אקטין mRFP היה מגורה באופן מכני על ידי AFM ו הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה ספינינג דיסק confocal החצים מצביעים על סיבי אקטין כי:. (א) לפלמר / לעבות, (ב) depolymerize / נעלמים, או (ג) צרור יחד בשל על ארגון מחדש אקטין. קווים מקווקווים לבן מייצגים את קצה AFM מעל התא. תמונה בגודל 91 x 91 מיקרון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

הידבקויות cytoskeleton 7-10 ו 11-16 הם מבנים מוקד דינמי להרכיב, להתפזר להתהפך כמו תאים נודדים או להגיב בכוח מכני 17. יש להם פונקציות משמעותי בוויסות גדילת התאים, הישרדות, ועל ביטוי גנים. ידיעת התפלגות הספציפיים שלהם ואת הדינמיקה מספקת הבנה טובה יותר של האופן שבו תאים לתקשר עם מטריקס ו - בינם לבין עצמם.

מערכת זו המיקרוסקופ החדש ישים רחב על פני מגוון רחב של מחקרים דינמי מולקולריים בתאים חיים כל חסיד. המיקרוסקופ משולב המאפשר מעקב כמותי של המשנה הסלולר שינויים מהירים ומספק כלי רומן חשובים להבנת תהליך שיפוץ יסודי של הסלולר בתגובה לכוח מכני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements: תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

Vinculin-GFP הפלסמיד היה מתנה קנת יאמאדה, המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי למחקר דנטלי Craniofacial, Bethesda, מרילנד, אקטין mRFP הפלסמיד היה מתנה מיכאל דוידסון, פלורידה סטייט, Tallahassee, פלורידה.

עבודה זו נתמכה על ידי בפרס קריירה NSF # 0747334 ו - AHA-National SDG # 0835205N כדי אנדריאה קנה הנשימה.

Materials: תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

Name Company Catalog Number Comments
AFM tip Novascan Technologies, Inc. 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface
avidin Sigma-Aldrich A9275 1mg/mL in DPBS
Fibronectin Sigma-Aldrich F4759 1 mg/mL
DPBS Invitrogen 21600-051
Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells Lonza Inc. VPI-1004
Mattek glass bottom dishes MatTek Corp. P60G-1.5-30-F Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5

References: תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

  1. Trache, A. & Lim, S.M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt 14, 034024 (2009).
  2. Trache, A. & Meininger, G.A. Atomic Force Microscopy' in Current Protocols in Microbiology. R. Coico, T. Kowalik, J.M. Quarles, B. Stevenson & R.K. Taylor eds., Wiley & Sons Inc., 2C, 2.1-17 (2008a).
  3. Axelrod, D., Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt 6, 6-13 (2001).
  4. Trache, A. & Meininger, G.A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. in Current Protocols in Microbiology, R. Coico, T. Kowalik, J.M. Quarles, B. Stevenson & R.K. Taylor eds., Wiley & Sons Inc., 2A, 2.1-22 (2008b).
  5. Inoue, S. & Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol 70, 87-127 (2002).
  6. Binnig, G., Quate, C.F., & Gerber, C.H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett 56, 930-933 (1986).
  7. Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol 163, 25-32 (2008).
  8. Gunst, S.J., Tang, D.D. & Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol 137,151-168 (2003)
  9. Ingber, D.E. Mechanical signaling & the cellular response to extracellular matrix in angiogenesis and cardiovascular physiology. Circ Res 91, 877-887 (2002).
  10. Worth, N.F., Rolfe, B.E., Song, J. & Campbell, G.R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton 49, 130-145 (2001).
  11. Romer, H.R., Birukov KG & Garcia JGN. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research 98, 606-616 (2006).
  12. Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C.E., Tang, D.D., & Gunst, S.J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol 286, C433-C447 (2004).
  13. Alenghat, F.J. & Ingber, D.E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE 119: PE6(1-4) (2002).
  14. Zamir, E. & Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci 114, 3583-3590 (2001).
  15. Geiger, B. & Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol 13, 584-592 (2001).
  16. Sastry, S.K. & Burridge, K., Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res 261, 25-36 (2000).
  17. Orr, A.W., Helmke, B.P., Blackman, B.R., Schwartz, M.A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell 10, 11-20 (2006).

Ask the Author: תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter