El grano y Pruebas de Manejo de Capellini: Simple medidas cuantitativas de la función de las patas delanteras diestro en ratas y ratones

1. Preparación para el inicio de la prueba

1. Pastas alimenticias sin cocer piezas se cortan a la longitud de una hoja de afeitar. Para las ratas, Skinner marca de fideos de pasta (1,5 mm de diámetro) se reduce a 7 cm de largo. En los ratones, DeCecco marca Capellini pastas (1,0 mm de diámetro) se reduce a 2,6 cm de largo (Fig. 1C). Debido a que las marcas de pasta varían en textura y diámetro, lo que podría influir en forma de manipulación, se recomienda que una sola fuente de la pasta se utiliza para repetir la prueba.
2. Para superar las respuestas neofóbico y establecer habilidad en el manejo, los animales son expuestos a las piezas de pasta en sus tiempos de su casa varias jaulas en las semanas antes de la prueba. (Por lo general, 5-10 días de la exposición, alrededor de 4 piezas cada vez, es suficiente.)
3. Si la prueba se administra en una cámara que no sea la jaula, o si la jaula se mueve para las pruebas, habituación a comer en el entorno de prueba se proporciona. (Por lo general toma 3-5 sesiones hasta que los animales son fáciles de comer la pasta en este entorno.)
4. Incluso después de que los animales aceptan con avidez las pastas, de repente puede llegar a ser reticentes a la hora de una cámara grande se mueve junto a la zona de pruebas. Es útil para colocar la cámara en frente del entorno de prueba de uno o más de las sesiones de habituación.
5. Porque la mayoría de los animales actúan como si la pasta es muy apetecible, no es esencial para la alimentación restringirlas antes de la prueba. Sin embargo, la eliminación de la comida unas horas antes o durante la noche puede facilitar el comer delante de la cámara y el experimentador y asegurarse de que no están satisfechos en el momento de prueba.
6. Romper el trozo de pasta durante la comida invalida el juicio. Hemos encontrado que este hábito es evitar en gran medida si los animales no se dan las piezas más largas que las utilizadas en las pruebas.
7. Para las sesiones de pruebas, piezas de pasta se marcan con un marcador de punta ultrafina a intervalos específicos mediante una plantilla de cartulina (1,75 cm en incrementos de fideos y 0,86 cm en incrementos de hilos Capellini). Esto facilita la visualización del movimiento de la hebra de la pasta durante la comida.

2. Prueba establecido

1. Animales deben estar expuestos, ya sea en la jaula de alojamiento u otro aparato con paredes que no este atado, claro, y deben ser aislados de su cagemates durante la sesión de prueba.
2. Aunque las ratas pueden ser probados en tiempo real por un experimentador practicado (Allred et al., 2008), la cuantificación se ve facilitada por la grabación de vídeo para que los datos se pueden recoger durante la reproducción de vídeo a cámara lenta. No hemos encontrado es factible cuantificar de forma fiable los movimientos del ratón pata sin reproducción a cámara lenta de movimiento por vídeo, debido al pequeño tamaño de sus patas y movimientos rápidos.
3. Una cámara de vídeo con una alta velocidad de cuadro y el zoom adecuado se utiliza. Usamos una cámara Canon XL1S con un zoom total de 16X ajustada a una velocidad de obturación de un mínimo de 420 s-1 en condiciones normales de iluminación de la habitación. El uso de un trípode con ruedas, con una cabeza panorámica e inclinación facilita el posicionamiento de la cámara.
4. Las ratas suelen sentarse en posición vertical sobre sus patas traseras para comer las pastas y las patas son más fáciles de visualizar con la cámara colocada aproximadamente a nivel del piso de la cámara con una ligera inclinación hacia arriba (Fig. 1A). Si las pruebas en una jaula de virutas, la eliminación de algunas virutas puede ser útil para optimizar la vista.
5. Los ratones tienden a inclinarse hacia adelante durante la comida de pasta, la celebración de la pieza a más de un ángulo que hacen las ratas. Por lo tanto, una cámara de prueba con una planta abierta se coloca en la parte superior de un espejo. La cámara se coloca en un nivel ligeramente más alto que el suelo y en ángulo hacia abajo para centrarse en la reflexión de las patas en el espejo (fig. 1B). El uso de un espejo de primera superficie mejora la claridad de las patas de la reproducción de vídeo.
6. Cada bocado de la pieza de pasta es audible y, por tanto, la grabación de audio es útil para verificar la alimentación.

3. La administración de los ensayos de pasta de manejo

1. Sesiones de pruebas consisten en pruebas secuenciales, con la pieza de pasta comido por un juicio. Nos suelen registrar los datos de los ensayos 4.5 por rata y ensayos 3.4 por ratón.
2. Antes de grabar en vídeo, un trozo de pasta se coloca en la cámara para iniciar la comida y para mover al animal en una cámara de visión adecuada.
3. Es necesario que el animal para hacer frente a la cámara y de enfoque y el zoom lo suficiente (unos 10-12X) para ver los ajustes discretos con dos patas delanteras y todos los dígitos. Los nudillos de las dos patas debe ser visible. Al menos con esta cámara, creemos que es útil para utilizar las funciones de enfoque automático sólo antes del inicio del juicio, para reducir en la región de interés. Estamos posteriormente cambiar a enfoque manual.
4. Tan pronto como el animal y la cámara están en posición, el primer juicio se inicia. Una pieza se cae o se colgaban directamente en frente del animal y la grabación se inicia antes de comer inicio.
5. A partir de entonces, los ensayos se dan en sucesión inmediata. Es aconsejable reducir al mínimo los retrasos entre los ensayos para que los animales no se alejendesde la posición de visualización óptima.
6. Ensayos en los que las patas se ven al lado o en el que se concentran se pierde no se anotó.
7. Las sesiones de prueba se puede repetir durante días, por ejemplo, para documentar la pre-y post-tratamiento patrones temporales (por ejemplo, la recuperación después de una lesión del SNC;. Allred et al, 2008).
8. Un desafío se puede conseguir animales para comer en las posiciones deseadas en relación con la cámara. Puede que sea necesario para habituar a los animales tímidos ante la cámara-a la presencia de la cámara durante unos minutos antes de la prueba. Los animales a menudo pueden ser inducidas a la posición de una caída o colgando de pasta en la región ideal. Se puede requerir unas pocas piezas para llevar a cabo esta posición deseada, aunque el número de piezas dado deben reducirse al mínimo para evitar la sensación de saciedad.
9. Para la prueba secuencial de varias ratas, hemos encontrado que es conveniente configurar algunos de sus jaulas en un momento en un círculo, con la cámara en un trípode con ruedas en el centro. Una pieza se coloca en una región ideal de cada jaula y la cámara luego se trasladó a la rata que empieza a comer en una posición adecuada en primer lugar. Esto permite más tiempo para el más lento (para comer en la posición) de las ratas se acostumbran a la presencia de la cámara y el experimentador y también pueden ser estimulados a comer por los sonidos de mordida de las ratas más rápido.

4. Análisis cuantitativo de los ajustes de vídeo pata y el tiempo de comer

1. El análisis de los ajustes de pata durante la comida es una medida cuantitativa simple que es sensible a las alteraciones lateralizado después de una lesión del SNC en ratas (Allred et al, 2008;. Whishaw y Coles, 1996; Whishaw et al, 1997.) Y al envejecimiento de los cambios relacionados con en ratones (Tennant et al., 2009).
2. La parte cuantitativa del estudio se inicia cuando la pieza de pasta se coloca primero en la boca y termina cuando el último de la pasta se libera de las garras y desaparece en la boca.
3. La reproducción de vídeo es más lento (~ 50% de tiempo real), o el avance de cuadro por cuadro se utiliza, según sea necesario, para identificar los ajustes.
4. Un ajuste se cuenta cada vez que los comunicados de la pata y volver a contactos-la pieza de pasta, cuando no es una reforma de la bodega de la pata de la pieza, o cuando hay una extensión, flexión o abducción aducción de los dedos (Fig. 2). Cada ajuste se registra por separado para la pata izquierda y derecha.
5. Los ajustes no se cuentan cuando la pata se desliza a través de la pieza de pasta con ningún movimiento de los dedos o la reposición de la bodega de pata. Los movimientos de la pata cuando no está en contacto con la pieza de pasta (es decir, los movimientos al lado de la pieza) tampoco están contados.
6. La hora de comer también se registra para cada ensayo, comenzando con el consumo de inicio y finaliza cuando la pasta se pierde en la boca. Registramos el tiempo utilizando las funciones de visualización de vídeo de reproducción, pero también se puede grabar con un cronómetro en la velocidad de reproducción normal.
7. Si el animal hace una pausa para comer, pero mantiene un alto en la pieza, el tiempo de pausa se resta del tiempo total. Una pausa para comer es evidente por tanto el movimiento de la pieza de la boca o de la cesación de morder audible.
8. El juicio se omite en el análisis de si en cualquier parte de la alimentación, el punto de vista de las patas se oculta, o si el animal se rompe la pieza, ya que las piezas cortas alteran el control de los patrones.
9. Algunas ratas y ratones constantemente hacer más ajustes con una pata que el otro. Para unilateral modelos de lesión del SNC, las deficiencias son más lateralizado sensibilidad detecta si las lesiones afectan a la pata que hizo más ajustes antes de la lesión en las pruebas (Allred et al., 2008).
10. Los ratones a veces caída de la pieza de pasta en el medio de comer, y, tras un breve descanso, recogerlo y seguir comiendo. Esto es más común en la última prueba del día, posiblemente debido a la saciedad y la pérdida parcial de centrarse en comer. Debido a esto es común incluso en ratones intactos, no omitir estos ensayos. Sin embargo, el tiempo que la pieza se cae se resta del tiempo total de comer.
11. En ratas intactas, cayendo piezas es atípico y la reanudación de la alimentación es a menudo muy retrasado o ausente. Dichos ensayos se han omitido en el análisis de los ajustes y el tiempo de comer.
12. Ajustes antes de la aparición de comer no se cuentan. Pre-manejo de las conductas alimentarias se ven afectados por lesiones del SNC (por ejemplo, Whishaw et al, 1992;.. Whishaw et al, 1986), pero todavía no han hecho los métodos cuantitativos para ajustes de pata de este período.
13. Estos datos se pueden resumir como: (a) el número medio de ajustes por la pata por pieza, (b) el tiempo promedio de consumo por unidad y (c) el tipo de ajustes (ajustes / hora de comer).

5. Vídeo análisis de los patrones de manejo de atípicos

1. Patrones atípicos de manipulación pueden distinguir entre diferentes tipos de lesiones del SNC en ratas (Allred et al., 2008) y recording estos comportamientos puede ser útil como un análisis suplementario.
2. Los patrones de manejo se consideran atípicas si se observa con poca frecuencia en los animales intactos. Animales intactos suelen iniciar a comer con una pata, la "pata de comprender", situada más abajo en la pasta, y la "pata de guía" se coloca cerca de la boca (Fig. 3 A, C). La pata misma suele ser la pata de captar en todos los ensayos. Las ratas a menudo la posición de las patas muy separadas a lo largo de la pasta en un primer momento, y se mueven juntos en la pieza se acorta. Los ratones normalmente la posición de las dos patas cerca de la boca, con el alcance y las extremidades guía celebrado cerca uno del otro, incluso al principio de la comida. En ambas especies, las patas se mueven a posiciones más simétricas, de lado a lado o con dígitos interpuesta, cuando la pieza es muy corto (Fig. 3B, D). Tanto las patas son de uso continuo para orientar, mantener o avanzar en la pasta durante la comida.
3. Patrones atípicos en la posición de la pata en ratas y ratones son: (a) la colocación de las patas juntas, en una bodega simétrica, cuando la pieza de pasta larga (más de la mitad de la longitud original), (b) a falta de mover las patas en una posición simétrica antes de que la pieza está totalmente consumido y (c) cambio de posiciones de la guía y los miembros captar en el medio de comer.
4. Dos comportamientos atípicos adicionales en ratas y ratones son: (a.) La falta de contacto con la pieza de pasta con una pata por un tiempo prolongado durante la comida ("la falta de contacto") y (b) usar la boca para sacar la pasta a través de la patas para colocar ("boca tirando").
5. Dos conductas que se consideran atípicos para las ratas, pero son típicos de los ratones: (a.) y postura encorvada (b) dejar caer el pedazo de pasta después de comer comienza. Sin embargo, la frecuencia de las caídas en los ratones puede aumentar después de daño en el SNC. Por lo tanto, registrar la frecuencia baja en ambas especies.
6. Otras conductas atípicas se han visto en una rata modelo unilateral agotamiento de la dopamina del estriado: (a.) una "mano de hierro", donde el miembro alcance se mantiene en una posición inmóvil, rígido durante la comida, (b) repetir el movimiento de la pata guía alrededor de la pata captar rígido, y (c) y la inclinación extrema de la cabeza como la pasta tiene un ángulo en la boca (Allred et al, 2008;. véase también Whishaw et al 1997)..
7. Hemos observado que los ratones de edad suelen hacer los ajustes que son ineficaces para mover la pasta en la boca. Por lo tanto, los ajustes que no dan lugar a un movimiento visible de la pieza de pasta en la boca se registran por separado.
8. Cambio de la guía y las extremidades entender, las fallas de contacto, gotas, y la boca tirando se registran por ocurrencia, mientras que todos los comportamientos atípicos se registran una vez al juicio.

6. Resultados representante

Los resultados de los análisis de video debe incluir el número de ajustes de cada pata por ensayo y el tiempo para comer cada pieza de pasta. Los resultados de las ratas con lesiones sensoriomotor cortical o isquemia cerebral indican que los animales que menos ajustes con las personas con discapacidad (contra-to de la lesión) miembros, un efecto que dura por lo menos un mes después de las lesiones. Unilateral de dopamina provoca el agotamiento de tanto en una disminución en los ajustes con la extremidad contralateral y un aumento en los ajustes con el miembro ipsilateral (Allred et al., 2008). Los resultados de los ratones muestran que los animales de tener más tiempo para comer los trozos de pasta, y hacer más ajustes que no resulten en el progreso de la pasta en la boca, en comparación con los ratones adultos jóvenes (Tennant et al., 2009). El análisis de estas pruebas también pueden incluir observaciones de comportamientos atípicos de manipulación. Daños estriado y la oclusión de arteria cerebral media, además, dio lugar a una mayor frecuencia de comportamientos alimentarios anormales (Allred et al., 2008).

Figura 1. Postura Pasta manejo de (A) las ratas y los ratones (B). Tenga en cuenta que las ratas sentarse en cuclillas mientras que los ratones presentimiento sobre la pasta, lo que exige la colocación de un espejo por debajo del ratón para poder ver los movimientos de la pata. (C) Algunos ejemplos de piezas de pasta preparados para la prueba.

Figura 2. Un ejemplo de ajuste de las patas delanteras (AC) y una rata (DF) de un ratón. El primer panel muestra el animal antes del ajuste, el panel central muestra el ajuste de las patas delanteras, con un asterisco que indica la pata de ajuste (s), y el último panel muestra la sustitución de la pieza de pasta.

Figura 3. Guía y comprender las posiciones del miembro de ratas y ratones cuando la pasta está (A, C) de largo y (B, D) corto.

En este video, que demuestran cómo los fideos y Pruebas de Manejo de Capellini se llevan a cabo en ratas y ratones, respectivamente. Estas pruebas son una forma sencilla y cuantitativos para estudiar la pata y la función de dos dígitos en los animales normales, después de un daño a los sistemas motores del cerebro, o durante el envejecimiento. Video en cámara lenta el análisis de la pata y los movimientos de dígitos que se utiliza para manejar pequeñas piezas de pasta sin cocer permitirá a los investigadores para cuantificar los ajustes realizados con cada pata, así como observar el comportamiento anormal que puede observarse después de un daño en el SNC inducida experimentalmente. Sesiones de prueba se puede hacer varias veces en diferentes días y la mayoría de los animales de concluir todos los juicios de una sesión de pocos minutos. Por lo tanto, la prueba es adecuada para su incorporación a una batería de pruebas más grande o el diseño experimental. Las pruebas también se pueden utilizar en los estudios de capacidad de aprendizaje motor (Xu et al., 2009), pero aquí se presenta un protocolo de ensayo de los cambios en una habilidad en el tiempo establecido.

En la actualidad, las pruebas de expertos de llegar son las pruebas más utilizadas de la función de miembro superior diestro en las ratas (por ejemplo, Whishaw et al, 1986;. Ballermann et al, 2001;. Montoya et al, 1991.) Y ratones (Farr y Whishaw, 2002; Tennant y Jones, 2009; Baird et al, 2001).. Pruebas permiten llegar a las pruebas aisladas de cada miembro, mientras que el manejo de la pasta es una tarea bimanual. Sin embargo, las pruebas son similares en su sensibilidad a alteraciones en la función de pata calificados y la adquisición de habilidades para las dos pruebas consiste en la plasticidad de la representación extremidad anterior de la corteza motora (Xu et al., 2009). En nuestra experiencia, las pruebas de alcance es más complicado y laborioso de realizar y, para algunas preguntas experimentales, las pruebas actuales pueden proporcionar una alternativa más eficiente. Sin embargo, a diferencia de las pruebas que se describen aquí, las pruebas de expertos llegando a haber estado en uso durante décadas (Peterson, 1934) y ahora incluyen un amplio campo de medidas de alta sensibilidad y parámetros de prueba (Ballermann et al, 2001;. Farr & Whishaw, 2002; Montoya et al, 1991;. Whishaw et al, 1992).. Por el contrario, los fideos y las pruebas de manipulación Capellini se extienden desde las caracterizaciones relativamente reciente de la conducta alimentaria hábil manejo de las ratas (Whishaw y Coles, 1996). En la administración y el análisis, estas pruebas, sin duda, podría mejorarse y ampliarse, por ejemplo, para cuantificar con más precisión los patrones de movimiento fino dígitos y bimanual y cuantificar la coordinación de los movimientos de la lengua, la boca y la mandíbula.

No hay conflictos de interés declarado.

Los autores desean agradecer a la Dra. Deanna Adkins, Dr. Marty Woodlee, esposos Cole, Mónica A. Maldonado, Kane Jackie, y el Dr. Tim Schallert de asistencia en el desarrollo de la Prueba de Manejo de fideos, y Lu Chou de asistencia en el desarrollo de la Capellini Prueba de manejo. Apoyado por becas de los NIH, NINDS (NS05689) y NIH-NIA (1F31AG034032-01).

1. Allred, R.P., Adkins, D.L., Woodlee, M.T., Husbands, L.C., Maldonado M.A., Kane, J.R., Schallert, T. & Jones, T.A. The Vermicelli Handling Test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats. J. Neurosci. Methods 170, 229-244 (2008).
2. Baird, A.L., Meldrum A. & Dunnett, S.B. The staircase test of skilled reaching in mice. Brain Res. Bull. 54, 243-250 (2001).
3. Ballermann, M., Metz, G.A., McKenna, J.E., Klassen, F. & Whishaw, I.Q. The pasta matrix reaching task: a simple test for measuring skilled reaching distance, direction, and dexterity in rats. J. Neurosci. Methods 106, 39-45 (2001).
4. Castro, A.J. Motor performance in rats. The effects of pyramidal tract section. Brain Res. 44, 313-323 (1972).
5. Farr, T.D. & Whishaw, I.Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke 33, 1869-1875 (2002).
6. Montoya, C.P., Campbell-Hope, L.J., Pemberton K.D. & Dunnett, S.B. The staircase test : a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J. Neurosci. Methods 36, 219-228 (1991).
7. Peterson, G.M. Mechanism of handedness in the rat. Comp Psych Monographs 9, 1-67 (1934).
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9. Tennant, K.A. & Jones, T.A. Sensorimotor behavioral effects of endothelin-1 induced small cortical infarcts in C57BL/6 mice. J. Neurosci. Methods 181, 18-26 (2009).
10. Whishaw, I.Q. & Coles, B.L. Varieties of paw and digit movement during spontaneous food handling in rats: postures, bimanual coordination, preferences, and the effect of forelimb cortex lesions. Behav. Brain Res. 77, 135-148 (1996).
11. Whishaw, I.Q. Coles, B.L., Pellis, S.M., & Miklyaeva, E.I. Impairments and compensation in mouth and limb use in free feeding after unilateral dopamine depletions in a rat analog of human Parkinson s disease. Behav Brain Res. 84, 167-177 (1997).
12. Whishaw, I.Q., Dringenberg, H.C. & Pellis, S.M. Spontaneous forelimb grasping in free feeding by rats: motor cortex aids limb and digit positioning. Behav. Brain Res. 48, 112-125 (1992).
13. Whishaw, I.Q., O Connor, W.T. & Dunnett, S.B. The contributions of motor cortex, nigrostriatal dopamine and caudate-putamen to skilled forelimb use in the rat. Brain 109, 805-843 (1986).

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