O Vermicelli e Testes Handling Capellini: Simple medidas quantitativas da função forepaw dexterous em ratos e camundongos

1. Preparando-se para o início de testes

1. Massas alimentícias não cozidas peças são cortadas ao comprimento usando uma lâmina de barbear. Para ratos, Skinner marca vermicelli massas (1,5 mm de diâmetro) é cortado para comprimentos 7 cm. Para ratos, DeCecco marca capellini massas (1,0 mm de diâmetro) é cortado para 2,6 comprimentos cm (Fig. 1C). Porque os tipos de massas variam em textura e diâmetro, o que poderia influenciar maneira manuseio, recomenda-se que uma única fonte de massas ser usado para testes repetidos.
2. Para superar as respostas neofóbicas e estabelecer habilidade no manuseio, os animais estão expostos às peças massas em sua casa gaiola várias vezes nas semanas antes do teste. (Normalmente, 5-10 dias de exposição, cerca de 4 peças de cada vez, é suficiente.)
3. Se o teste será administrado em uma câmara que não seja a gaiola, ou se a gaiola é movido para a habituação testes, a comer no ambiente de testes é fornecida. (Ele normalmente leva 3-5 sessões até que os animais são facilmente comer o macarrão neste ambiente.)
4. Mesmo depois de aceitar animais ansiosamente pasta, eles podem tornar-se subitamente reticentes quando uma câmera grande é movido ao lado da área de testes. É útil para colocar a câmera na frente do ambiente de teste para uma ou mais das sessões de habituação.
5. Porque a maioria dos animais agem como se a massa é altamente palatável, não é essencial à alimentação restringi-los antes do teste. No entanto, a remoção de alimento poucas horas antes ou durante a noite pode facilitar a comer na frente do pesquisador e da câmera e garantir que eles não são saciados, no momento do teste.
6. Quebrando o pedaço de massa durante a comer invalida um julgamento. Temos achado que este hábito é amplamente evitada se os animais nunca são dadas peças mais do que os usados ​​nos testes.
7. Para as sessões de testes, pedaços de massa são marcadas com um marcador de ponta ultrafinas em intervalos específicos utilizando um modelo de cartolina (1,75 cm em incrementos de vermicelli e 0,86 cm em incrementos de fios capellini). Isso facilita a visualização do movimento de massas da vertente durante comer.

2. Teste criado

1. Animais devem ser testados em qualquer casa gaiola ou outro aparelho com unmarred, paredes claras, e devem ser isolados de seus cagemates durante a sessão de teste.
2. Apesar de ratos pode ser testado em tempo real por um experimentador praticada (Allred et al., 2008), a quantificação é facilitada pela gravação de vídeo para que os dados podem ser coletados durante slow-motion reprodução de vídeo. Não encontramos viável a quantificar de forma confiável os movimentos das patas dianteiras mouse sem playback slow motion video, devido ao pequeno tamanho de suas patas e movimentos rápidos.
3. Uma câmera de vídeo com uma alta taxa de quadros e zoom adequada é usado. Nós usamos uma câmera Canon XL1S com uma lente zoom de 16X definida para uma velocidade de obturador de pelo menos 420 s-1, em condições normais de iluminação do quarto. O uso de um tripé com rodas com uma cabeça panorâmica e inclinação facilita o posicionamento da câmera.
4. Ratos normalmente sentam na posição vertical sobre suas ancas para comer massas e as patas são mais facilmente visualizados com a câmera posicionada no nível do chão cerca de câmara com um ligeiro ângulo para cima (Fig. 1A). Se o teste em uma gaiola com lascas, remoção de algumas aparas pode ser útil para otimizar a visualização.
5. Camundongos tendem a dobrar para a frente durante a comer massas, segurando o pedaço a mais de um ângulo que os ratos fazem. Assim, uma câmara de teste com um assoalho aberto é colocado em cima de um espelho. A câmera é colocada a um nível ligeiramente superior ao chão, e em ângulo para baixo, para concentrar-se na reflexão das patas no espelho (Fig. 1B). O uso de um espelho primeira superfície melhora a clareza das patas para reprodução de vídeo.
6. Cada mordida do pedaço de massa é audível e, assim, a gravação de áudio é útil para verificar comer.

3. Administrando ensaios manipulação de massas

1. Sessões de testes consistem em ensaios sequenciais, com um pedaço de massa comido por julgamento. Normalmente, registro de dados de ensaios 4-5 por ratos e ensaios 3-4 por mouse.
2. Antes de filmar, um pedaço de macarrão é colocado na câmara para iniciar comer e para mover o animal em uma visão de câmera apropriado.
3. É necessário que o animal para enfrentar a câmera e foco e zoom suficiente (~ 10-12X) para visualizar ajustes discretos com ambas as patas dianteiras e todos os dígitos. Os nós dos dedos de ambas as patas devem ser visíveis. Pelo menos com esta câmera, nós achamos que é útil para usar os recursos de foco automático apenas antes do início do estudo, para diminuir em na região de interesse. Nós posteriormente mudar para foco manual.
4. Assim que o animal ea câmara estão em posição, o primeiro julgamento é iniciado. A peça é derrubado ou dangled diretamente na frente do animal e de gravação é iniciado antes de comer início.
5. Posteriormente, os ensaios são dadas em sucessão imediata. Aconselha-se a minimizar os atrasos entre os ensaios para que os animais não se afastara partir da posição de visualização ideal.
6. Ensaios em que as patas são vistos ao lado ou em que o foco é perdido não são pontuados.
7. As sessões de teste pode ser repetido ao longo de dias, por exemplo, para documentar pré e pós-tratamento padrões temporais (por exemplo, a recuperação após a lesão do SNC;. Allred et al, 2008).
8. Um desafio pode estar recebendo animais para comer em posições desejadas em relação à câmera. Pode ser necessário habituar-câmera tímida animais à presença da câmera por alguns minutos antes do teste. Animais muitas vezes podem ser estimulados a posição por uma queda ou dangling massas na região ideal. Ela pode exigir algumas peças para realizar esta posição desejada, embora o número de peças apresentadas devem ser minimizados para evitar a saciedade.
9. Para o teste seqüencial de vários ratos, nós descobrimos que é conveniente para configurar algumas das suas gaiolas em um momento em um círculo, com a câmera em um tripé com rodas no meio. A peça é deixado em uma região ideal de cada gaiola ea câmera então se mudou para o rato, que começa a comer em uma posição apropriada em primeiro lugar. Isto permite mais tempo para o mais lento (para comer em posição) ratos para tornar-se habituado à presença da câmera e experimentador e eles também podem ser estimuladas a comer pelos sons mordida dos ratos mais rápido.

4. Análise quantitativa de ajustes de vídeo forepaw e tempo de comer

1. A análise de ajustes durante forepaw comer é uma medida quantitativa simples que é sensível à deficiência lateralizada após lesão do SNC em ratos (Allred et al, 2008;. Whishaw & Coles, 1996; Whishaw et al, 1997.) E ao envelhecimento mudanças relacionadas em camundongos (Tennant et al., 2009).
2. A porção quantificados do julgamento começa quando o pedaço de massa é o primeiro colocado na boca e termina quando o último dos pasta é liberada a partir das patas e desaparece na boca.
3. Reprodução de vídeo fica lento (~ 50% do tempo real), ou quadro a quadro de avanço é utilizado, quando necessário, para identificar os ajustes.
4. Um ajuste é contada cada vez que o libera pata e re-contato com o pedaço de massa, quando há reforma do porão pata sobre a peça, ou quando existe uma extensão de flexão ou abdução-adução dos dedos (Fig. 2). Cada ajuste é registado separadamente para a pata esquerda e direita.
5. Ajustes não são contados quando a pata slides em todo o pedaço de massa com nenhum movimento dos dígitos ou reposicionamento do porão pata. Movimentos da pata quando não está em contato com o pedaço de massa (isto é, movimentos ao lado da peça) também não são contados.
6. A hora de comer também é registrado para cada ensaio, começando com a alimentação início e termina quando a massa desaparece na boca. Gravamos tempo usando recursos de vídeo display de reprodução, mas também pode ser gravado com um cronômetro durante a reprodução velocidade normal.
7. Se o animal pára de comer, mas mantém uma segurar a peça, o tempo de pausa é subtraído do tempo total. Uma pausa para comer é evidente pelo movimento da parte da boca ou da cessação de morder audível.
8. O julgamento é omitido da análise, se durante qualquer parte do comer, a visão das patas é obscurecida, ou se o animal quebra da peça, porque as peças mais curtas alter manipulação de padrões.
9. Alguns ratos e camundongos consistentemente fazer os ajustes mais com uma pata que o outro. Para unilateral modelos SNC lesões, deficiências lateralizada são mais sensível à detecção se as lesões afetam a pata que fez ajustes mais em testes de pré-lesão (Allred et al., 2008).
10. Camundongos, por vezes, largar o pedaço de massa no meio de comer, e, após uma pequena pausa, buscá-lo e continuar a comer. Isso é mais comum no último ensaio do dia, possivelmente devido à saciedade parcial e perda de foco em comer. Porque isso é comum, mesmo em camundongos intactos, nós não omitir estes ensaios. No entanto, o tempo que a peça é descartada é subtraído do tempo total de comer.
11. Em ratos intactos, deixando cair pedaços é atípica e retomada em comer muitas vezes é muito demorada ou ausência. Tais ensaios são omitidos na análise de ajustes e tempo de comer.
12. Ajustes antes do início comer não são contados. Comportamentos pré-tratamento de comer são afetadas por lesões do SNC (por exemplo, Whishaw et al, 1992;.. Whishaw et al, 1986), mas ainda não estendeu a métodos quantitativos para ajustes forepaw a esse período.
13. Estes dados podem ser resumidas como: (a) o número médio de ajustes por pata por peça, (b) o tempo médio de comer por peça e (c) A taxa de ajustes (ajustes / comer tempo).

5. Análise de vídeo dos padrões de movimentação atípica

1. Padrões de movimentação atípica pode distinguir entre diferentes tipos de lesões do SNC em ratos (Allred et al., 2008) e recording esses comportamentos pode ser útil como análise complementar.
2. Padrões de manipulação são consideradas atípicas se eles são raramente observadas em animais intactos. Animais intactos tipicamente iniciar comer com uma pata, a "pata compreender", colocado mais abaixo na pasta, e os "pata guia" é então colocado perto da boca (Fig. 3A, C). A pata mesma é geralmente a pata agarrar em todos os ensaios. Ratos, muitas vezes distantes patas posição ao longo do comprimento da massa num primeiro momento, e movê-los juntos como o encurta peça. Camundongos normalmente a posição de ambas as patas perto da boca, com a apreensão e membros guia realizada próximos um do outro, mesmo no início de comer. Em ambas as espécies, as patas mover-se em posições mais simétrica, lado a lado ou com dígitos interposta, quando a peça é muito curto (Fig. 3B, D). Ambas as patas estão em uso contínuo de orientação, exploração ou avanço da massa durante a alimentação.
3. Padrões atípicos na posição de pata em ratos e camundongos são: (a.) colocando as patas em conjunto, em um porão simétrica, quando a peça macarrão é longo (mais de metade do comprimento original), (b) não mover as patas em uma posição simétrica antes da peça é completamente consumida e (c.) de comutação posições do guia e membros agarrar no meio de comer.
4. Dois outros comportamentos atípicos em ratos e camundongos são: (a.) não entrar em contato com o pedaço de massa com uma pata por um tempo prolongado durante a alimentação ("falta de contato") e (b) usando a boca para puxar a pasta por meio do patas para reposicioná-las ("boca puxando").
5. Dois comportamentos são considerados atípicos para ratos, mas são típicos de ratos: (a.) postura arqueada e (b.) deixando cair o pedaço de massa depois de comer começa. No entanto, a freqüência de quedas em ratos pode aumentar após a lesão do SNC. Assim, registramos queda de freqüência em ambas as espécies.
6. Outros comportamentos atípicos têm sido vistos em um modelo de remoção de ratos unilateral estriatal de dopamina: (a.) um "punho de ferro", onde o membro entender é realizada em uma posição, imóvel rígida durante a alimentação, (b.) repetiu o movimento da pata guia em torno da pata compreender rígida, e (c.) e inclinação extrema da cabeça como a massa é dobrada para dentro da boca (Allred et al, 2008;. ver também Whishaw et al 1997)..
7. Temos observado que os ratos idosos muitas vezes fazem ajustes que são ineficazes para mover a pasta na boca. Assim, os ajustes que não resultam em um movimento visível do pedaço de massa na boca são contabilizados separadamente.
8. Mudar o guia e membros agarrar, falhas de contacto, gotas, e da boca puxando são registrados por ocorrência, enquanto todos os outros comportamentos atípicos são gravados uma vez por julgamento.

6. Resultados representante

Os resultados da análise de vídeo deve incluir o número de ajustes de cada pata por tentativa e do tempo para comer cada pedaço de massa. Resultados de ratos com lesões corticais sensório-motor ou isquemia cerebral indicam que os animais produzem menos ajustes com o membro (contra-to-lesão) prejudicada, um efeito que perdura por pelo menos um mês depois dos ferimentos. Resultados dopamina unilateral esgotamento em ambos uma diminuição em ajustes com o membro contralateral e um aumento em ajustes com o membro ipsilateral (Allred et al., 2008). Resultados de ratos mostram que animais com idades demorar mais tempo para comer os pedaços de massa, e fazer os ajustes mais que não resultam em avanço da pasta na boca, em comparação com camundongos adultos jovens (Tennant et al., 2009). A análise desses testes também podem incluir observações de comportamentos movimentação atípica. Dano estriatal e oclusão da artéria cerebral média, adicionalmente, resultaram em aumento da freqüência de comportamentos alimentares anormais (Allred et al., 2008).

Figura 1. Postura Pasta manipulação de (A) ratos e (B) camundongos. Note-se que os ratos se sentar de cócoras, enquanto os ratos palpite sobre o macarrão, necessitando da colocação de um espelho abaixo do mouse para ver os movimentos da pata. (C) Exemplos de peças massas preparadas para o teste.

Figura 2. Um ajuste forepaw exemplo de (AC) e um rato (DF) um rato. O primeiro painel mostra o animal antes do ajuste, o painel central mostra o ajuste pata dianteira, com um asterisco indicando a pata de ajuste (s), e último painel mostra a substituição na peça macarrão.

Figura 3. Guia e compreender as posições dos membros de ratos e camundongos, quando a massa é (A, C) de comprimento e (B, D) de curta duração.

Neste vídeo, demonstramos como o Vermicelli e Testes Handling Capellini são realizados em ratos e camundongos, respectivamente. Estes testes são uma forma simples e quantitativa para estudar a pata e função dígitos em animais normais, após os danos aos sistemas de motor do cérebro, ou durante o envelhecimento. Slow-motion análise de vídeo da pata e movimentos dígitos usado para lidar com pequenos pedaços de massas alimentícias não cozidas permitir ao pesquisador a quantificar os ajustes feitos em cada pata, bem como observar comportamentos anormais que podem ser vistas abaixo, experimentalmente induzida, danos CNS. Sessões de teste pode ser feito várias vezes em dias diferentes ea maioria dos animais completar todos os testes de uma sessão dentro de alguns minutos. Assim, o teste é adequado para incorporação em uma bateria de testes maior ou desenho experimental. Os testes também podem ser usados ​​em estudos de habilidade motora de aprendizagem (Xu et al., 2009), mas aqui nós apresentamos um protocolo para mudanças ensaio em uma habilidade estabelecida ao longo do tempo.

Atualmente, qualificados testes atingir são os testes mais comumente utilizados da função forelimb dexterous em ratos (eg, Whishaw et al, 1986;. Ballermann et al, 2001;. Montoya et al, 1991.) E camundongos (Farr & Whishaw, 2002; Tennant & Jones, 2009; Baird et al, 2001).. Testes alcançando permitir testes isolados de cada membro, enquanto manipulação de massas é uma tarefa bimanual. No entanto, os testes são semelhantes em sua sensibilidade à deficiência na função forepaw qualificado ea aquisição de habilidades para ambos os testes envolve plasticidade na representação forelimb do córtex motor (Xu et al., 2009). Em nossa experiência, os testes alcançar são mais complicadas e trabalhosas para executar e, para algumas questões experimental, os testes de presente pode fornecer uma alternativa mais eficiente. No entanto, ao contrário dos testes descritos aqui, qualificados testes alcançando têm sido utilizadas há décadas (Peterson, 1934) e agora eles incluem um conjunto versátil de medidas altamente sensível e parâmetros de teste (Ballermann et al, 2001;. Farr & Whishaw, 2002; Montoya et al, 1991;. Whishaw et al, 1992).. Em contraste, o Vermicelli e Testes Handling Capellini se estendem desde as caracterizações relativamente recente do comportamento hábil manipulação de alimentos de ratos (Whishaw e Coles, 1996). Em administração e análise, esses testes poderiam, sem dúvida, ser aperfeiçoado e ampliado, por exemplo, para quantificar com mais precisão os padrões de movimento bem dígitos e bimanual e quantificar os movimentos coordenados da língua, boca e maxilar.

Não há conflitos de interesse declarados.

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. DeAnna Adkins, Dr. Marty Woodlee, Maridos Cole, Mónica Maldonado A., Jackie Kane, e Dr. Tim Schallert de assistência no desenvolvimento do Teste de Handling Vermicelli, e Lu Chou para assistência no desenvolvimento da Capellini manuseio de teste. Suportada por concessões do NIH-NINDS (NS05689) e NIH-NIA (1F31AG034032-01).

1. Allred, R.P., Adkins, D.L., Woodlee, M.T., Husbands, L.C., Maldonado M.A., Kane, J.R., Schallert, T. & Jones, T.A. The Vermicelli Handling Test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats. J. Neurosci. Methods 170, 229-244 (2008).
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