The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This article is a part of JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 107.22.127.92, User IP: 107.22.127.92, User IP Hex: 1796636508
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
Unable to load video. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
An unexpected error occurred. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model. J. Vis. Exp. (45), e2077, doi:10.3791/2077 (2010).
מודל ניסיוני עכבר גרורות גרורות הוא מודל פשוט עדיין רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. תאים סרטניים מוזרקים לווריד (iv) לתוך הוורידים זנב עכבר ליישב הריאות, ובכך, שמזכיר את הצעדים האחרונים של גרורות תאים סרטניים ספונטנית: הישרדות extravasation ההשאלה, והקולוניזציה באיברים דיסטלי. מבחינה טיפולית של נוף, מודל ניסיוני גרורות הוא הדגם הפשוט האידיאלי מאז היעד של טיפולים היא לעתים קרובות את נקודת הסיום של גרורות: גידול גרורתי הוקמה בשנת האיבר הדיסטלי. במודל זה, תאים סרטניים מוזרקים לתוך הוורידים iv העכבר הזנב מותר ליישב ולפתח את הריאות. גידול ספציפי ההרג מוזרקים אז iv לעכבר גרורות נושאות. המספר והגודל של גרורות הריאה ניתן לשלוט במספר תאים סרטניים להיות מוזרק והזמן של הגידול. לכן, בשלבים שונים של גרורות, גרורות מן מינימלית גרורות נרחב, יכול להיות המודל. גרורות הריאה מנותחים על ידי האינפלציה בדיו, ובכך מאפשר תצפית ויזואלית יותר קל וכימות.
ביום לפני זריקות תאים סרטניים, זרע אחד T75 עם בקבוק עד 1 x 10 7 CMS4-Met תאים 10 מ"ל של מדיום RPMI המכילה 10% נסיוב להשיג בצמיחה מהירה תאים סרטניים. דגירה לילה בשעה 37 ° C.
ביום של הזריקה, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים פעם עם PBS, אז הקציר תאים סרטניים עם 0.05% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. עצור את התגובה עם 10 מ"ל של מדיום RPMI סרום המכיל 10%. העברת התאים צינור חרוטי.
ספין למטה התאים ב 1300 סל"ד ב צנטריפוגה מקרא RT Sorvall 3 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant. Resuspend התאים טרי 10 מ"ל 1X HBSS לשטוף, אז ספין למטה שוב resuspend באותו אופן.
ספירת תאים סרטניים על hemocytometer. לדלל את התאים HBSS, כך התאים הדרושים כל הזרקה הם resuspended בנפח כולל של 100 μL.
חם 6-8 בן שבוע BALB / c עכברים בכוס שקוע במים חמים כדי להרחיב את הווריד הזנב. הנח את העכבר על עוצר זנב וריד על הספסל. השתמש microsyringe להזריק 100 μL של תאים סרטניים לווריד הזנב לרוחב. השתמש בטכניקה aseptic כדי למנוע זיהום. לאחר ההזרקה, להפעיל לחץ קל על הזריקה עד הדימום הפסיק.
החזר את העכבר בכלוב, ולאפשר הגידול לגדול לשלב הרצוי.
2. לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים (CTL) העברת המאמצת חיסוני
ביום ההעברה, פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend ציטוטוקסיות מטוהרים לימפוציטים מסוג T, או ההרג, מוכן כמתואר בטקסט. העברת כל התאים מהצלחת אחד צינור חרוטי 15 מ"ל, לא נותנים נפח יעלה יותר מ 2 / 3 של הצינור.
הכנס סטרילי פסטר פיפטה לתוך הצינור חרוטי ולהניח בינוני ההפרדה לימפוציטים, או LSM, תחת התאים עד הנפח הכולל מתקרב 14 מ"ל.
היזהר שלא להפריע את השכבות. צנטריפוגה בסל"ד 2000 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. אין להשתמש בבלם כדי להאט את הרוטור אחרי ספינינג.
מעבירים את ההרג על צינור חדש 15 מ"ל חרוטי. הוסף HBSS לנפח של כ -10 מ"ל לשטוף.
ספירת התאים. ספין למטה בסל"ד 1300 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend ב HBSS לצפיפות תא נדרש זריקות, תוך שמירה על הנפח הכולל לכל זריקה בבית μL 100.
שימוש באותה טכניקה הזרקת הזנב כפי שנראה קודם לכן סרטון זה להזריק את ההרג לתוך הגידול נושאות עכברים.
החזר את העכבר בכלוב, ולאפשר ההרג לקיים אינטראקציה עם הגידול. עכברים הם הקריבו בדרך כלל לניתוח 14-21 ימים לאחר הטיפול CTL.
3. ויזואליזציה של גרורות ריאות
כדי להמחיש גרורות ריאות, במקום עכבר הקריב על גבו על לוח קלקר. הצמד את הרגליים כדי להבטיח גישה בלא הפרעה לקנה הנשימה. תרסיס הצד הגחוני עם אתנול 70%.
החל מ הבטן באמצע, להשתמש במספריים לחתוך לאורך קו האמצע, דרך בית החזה, ואת לכיוון בלוטות הרוק. לחשוף את קנה הנשימה. שימוש במלקחיים כדי להסיר הרקמות הסובבות את הקנה.
נושא טיפ 200 פיפטה μL מתחת לקנה הנשימה. מחזיק את קצה ביד אחת, בעדינות להרים את קנה הנשימה מעלה מהגוף.
סובב את פלטפורמת 180 °. השתמש מזרק 50 מ"ל להזריק דיו הודו לריאות דרך קנה הנשימה. לגמרי לנפח את הריאות עם דיו עד שאתה מרגיש התנגדות חזקה.
השתמש מספריים כדי לחתוך את קנה הנשימה. Slide זוג מלקחיים תחת הריאות ולהרים אותם העכבר. שוטפים את הריאות בקצרה בכוס 1 ליטר של מים.
במנדף כימי קטר, להעביר את הריאות בקבוקון זכוכית scintillation המכיל 5 מ"ל של הפתרון של Fekete. רקמת הגידול תצא כמו גושים לבנים על הריאות שחור אחרי כמה דקות. גידולים יכולים כעת לסמוך ומאוחסנים הפתרון של Fekete ללא הגבלת זמן.
4. נציג גרורות בריאות דמיינו
הנה, הריאות מעכברים כי הוזרקו תאים החלב 4T1 קרצינומה קו להראות כתמים לבנים המעידים גידולים. עכברים הוזרקו תאים 4T1 transfected עם K79E דומיננטי שלילי IRF8 מוטציה להראות את הפוטנציאל גרורתי מוגברת של תאים סרטניים.
תמונות אלו מראות ניתוח היסטולוגית של יעילות חיסוני CTL העברת המאמצת. גידול נושאות עכברים שהוזרק עם מלוחים הראו גידולים מרובים 6 ימים לאחר מכן, שמסומן על ידי חיצים צהובים (A). עכברים שהוזרק עם גידול ספציפי בתאי T, לעומת זאת, הראה ירידה של גידולים (B).
בניסוי דומה, טיפול הודו דיו נותן דרך פשוטה למדוד את היעילות של העברת המאמצת CTL. כאן, גושים סרטניים לבן על נושאות גידולים הריאות הבחנה ברורה להם מהריאות שעברו בהצלחה העברת המאמצת CTL, וספירת גושים מאפשר לתוארשל quantitation לא אפשרי עם היסטולוגיה.
5. נציג תוצאות
באיור 1. תכנית ניסיונית עבור גרורות הגידול ניסיוניים CTL חיסוני אדפטיבית העברת במודל עכבר. נקודות אדומות מצביעות תאים סרטניים נקודות ירוק עולה ההרג.
איור 2. שיבוש של תפקוד משופר IRF8 פוטנציאל גרורתי של תאים סרטניים. עכבר החלב קרצינומה 4T1 הקו היה transfected ביציבות עם וקטור (4T1.Vector) או וקטור הבעת IRF8 דומיננטי שלילי מוטציה K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). תאים סרטניים הוזרקו לתוך ורידים iv העכבר הזנב לרוחב. גידול נושאות הריאות היו מנופחים עם דיו הודו לדמיין גושים סרטניים. גושים גידול נתפסים בקלות כמו כתמים לבנים על רקע שחור רקמת הריאות.
איור 3. ניתוח היסטולוגית של יעילות חיסוני CTL העברת המאמצת. סרקומה עכבר התא קו CMS4-Met שהוזרק לתוך הוורידים iv העכבר לרוחב הזנב. שלושה ימים לאחר מכן, מלוחים (א) או גידולים מסוימים בתאי T (B) הוזרקו נושאות גידולים בעכברים. ריאות נותחו שישה ימים לאחר הטיפול על ידי CTL מכתים H & E המקובלת היסטולוגית. גושים גידול מסומנים על ידי חצים.
איור 4. ויזואליזציה של גושים הגידול באינפלציה דיו בהודו. סרקומה עכבר התא קו CMS4-Met שהוזרק לתוך הוורידים iv העכבר לרוחב הזנב. שלושה ימים לאחר מכן, מלוחים (Control) או גידולים מסוימים בתאי T (+ CTL) הוזרקו נושאות גידולים בעכברים. ריאות נותחו ארבעה עשר ימים לאחר הטיפול CTL. כתמים לבנים, אשר הם גושים סרטניים, לאפשר כימות קל של יעילות הטיפול CTL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
עכברים נרכשו מן המכון הלאומי לסרטן (Friderick, MD) ו שוכנו הספר לרפואה של מתקן חיה ג'ורג'יה. ניסויים וטיפול / הרווחה היו בהסכם עם תקנות פדרליות ואת פרוטוקול שאושר על ידי בית הספר לרפואה של ג'ורג'יה IACUC הוועדה.
Pour 150 ml of distilled water into a 250 ml flask.
Add 4 drops ammonium hydroxide to the distilled water.
Add 30 ml India Ink stock (i.e. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) to the ammonia and water mixture.
Top off with distilled water to a volume of 200 ml. Solution is ready for injection.
Fekete’s Solution (17):
Fekete’s solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues.
Ryan, M.H., Bristol, J.A., McDuffie, E., Abrams, S.I. Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope. J Immunol 167 (8) : 4286-92 (2001).
Caldwell, S.A., Ryan, M.H., McDuffie, E., Abrams, S.I. The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases. J Immunol 171 (5) : 2402-12 (2003).
Liu, K., Caldwell, S.A., Greeneltch, K.M., Yang, D., Abrams, S.I. CTL Adoptive Immunotherapy Concurrently Mediates Tumor Regression and Tumor Escape. J Immunol 176 (6) : 3374-82 (2006).
Yang, D., Stewart, T.J., Smith, K.K., Georgi, D., Abrams, S.I., Liu, K. Downregulation of IFN-gammaR in association with loss of Fas function is linked to tumor progression. International journal of cancer 122 (2) : 350-62 (2008).
Pages, F., Berger, A., Camus, M., et al. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med 353 (25) : 2654-66 (2005).
Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F., et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science 313 (5795) : 1960-4 (2006).
Strater, J., Hinz, U., Hasel, C., et al. Impaired CD95 expression predisposes for recurrence in curatively resected colon carcinoma: clinical evidence for immunoselection and CD95L mediated control of minimal residual disease. Gut 54 (5) : 661-5 (2005).
Camus, M., Tosolini, M., Mlecnik, B., et al. Coordination of intratumoral immune reaction and human colorectal cancer recurrence. Cancer research 69 (6) : 2685-93 (2009).
Dudley, M.E., Wunderlich, J.R., Yang, J.C., et al. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol 23 (10) : 2346-57 (2005).
Srivastava, M.K., Sinha, P., Clements, V.K., Rodriguez, P., Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and cysteine. Cancer research; 70 (1) : 68-77 (2010).
Nagaraj, S., Gabrilovich, D.I. Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells. Cancer research 68 (8) : 2561-3 (2008).
Nguyen, D.X., Bos, P.D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature reviews 9 (4) : 274-84 (2009).
Heijstek, M.W., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I.H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Digestive surgery 22 (1-2) : 16-25 (2005).
Yang, D., Ud Din, N., Browning, D.D., Abrams, S.I., Liu, K. Targeting lymphotoxin beta receptor with tumor-specific T lymphocytes for tumor regression. Clin Cancer Res 13 (17) : 5202-10 (2007).
Yang, D., Thangaraju, M., Browning, D.D., et al. IFN Regulatory Factor 8 Mediates Apoptosis in Nonhemopoietic Tumor Cells via Regulation of Fas Expression. J Immunol 179 (7) : 4775-82 (2007).
Yang, D., Thangaraju, M., Greeneltch, K., et al. Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells. Cancer research 67 (7) : 3301-9 (2007).
Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. Journal of the National Cancer Institute 36 (4) : 641-5 (1966).
