Métastases expérimentales et CTL Modèle adoptifs souris Transfert immunothérapie

1. Modèle expérimental de la souris Métastases

1. Le jour avant les injections de cellules tumorales, une graine flacon T75 avec un maximum de 1 x 10 ⁷ CMS4-Met cellules dans 10 ml de milieu RPMI contenant 10% de sérum pour obtenir croissance rapide des cellules tumorales. Incuber une nuit à 37 ° C.
2. Le jour de l'injection, éliminer le milieu et rincer les cellules une fois avec du PBS, puis la récolte des cellules tumorales avec 0,05% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 5 minutes. Arrêter la réaction avec 10 ml de milieu RPMI contenant 10% de sérum. Transfert des cellules à un tube conique.
3. Isoler les cellules à 1300 rpm dans une centrifugeuse Sorvall Legend RT pendant 3 minutes à température ambiante. Enlever le surnageant. Resuspendre les cellules dans 10 mL frais 1X HBSS à laver, puis à nouveau spin-down et remettre de la même manière.
4. Compter les cellules tumorales sur un hématimètre. Diluer les cellules dans HBSS, de sorte que les cellules nécessaires à chaque injection sont remis en suspension dans un volume total de 100 ul.
5. Chauffer le 6-8 semaines vieilles souris Balb / c dans un bécher immergé dans l'eau chaude pour dilater la veine de la queue. Placez la souris sur une veine de la queue de contention sur le banc. Utilisez une microseringue à injecter 100 ml de cellules tumorales dans la veine latérale de la queue. Utiliser une technique aseptique pour éviter l'infection. Après l'injection, appliquez une légère pression au site d'injection jusqu'au saignement s'est arrêté.
6. Retour de la souris dans la cage, et permettre à la tumeur de croître sur la scène désirée.

2. Lymphocytes T cytotoxiques (CTL) Immunothérapie transfert adoptif

1. Le jour du transfert, une pipette de haut en bas pour resuspendre cytotoxique des lymphocytes T purifiés, ou CTL, préparé comme décrit dans le texte. Transfert de toutes les cellules d'une plaque à un tube de 15 ml coniques, ne laissant pas le volume dépasse de plus de 2 / 3 du tube.
2. Insérer une pipette Pasteur stérile dans le tube conique et laïcs milieu de séparation des lymphocytes, ou de LSM, sous les cellules jusqu'à ce que le volume total se rapproche de 14 ml.
3. Soyez prudent de ne pas déranger les couches. Centrifuger à 2000 rpm pendant 20 minutes à température ambiante. Ne pas utiliser le frein pour ralentir le rotor après le filage.
4. Transfert des CTL à un nouveau 15 ml tube conique. Ajouter HBSS à un volume d'environ 10 ml à laver.
5. Compter les cellules. Isoler à 1300 rpm pendant 5 minutes à température ambiante. Remettre en suspension dans HBSS à la densité de cellules nécessaires pour les injections, en gardant le volume total par injection à 100 pi.
6. Utilisez la technique d'injection queue mêmes comme vu plus tôt dans cette vidéo pour injecter le CTL en souris porteuses de tumeurs.
7. Retour de la souris dans la cage, et permettre au CTL à interagir avec la tumeur. Les souris sont souvent sacrifiés pour l'analyse de 14-21 jours après le traitement de CTL.

3. Visualisation des métastases pulmonaires

1. Pour visualiser les métastases pulmonaires, placer une souris sacrifiées sur son dos sur une planche en mousse de polystyrène. Pin des jambes pour assurer un libre accès à la trachée. Vaporisez la face ventrale avec de l'éthanol à 70%.
2. A partir du milieu de l'abdomen, utilisez des ciseaux pour couper le long de la ligne médiane, à travers la cage thoracique, et jusqu'à vers les glandes salivaires. Exposer la trachée. Utilisez une pince pour retirer les tissus entourant la trachée.
3. Enfilez une pointe de pipette 200 uL sous la trachée. Tenir la pointe d'une main, soulevez doucement la trachée et loin du corps.
4. Tournez la plate-forme de 180 °. Utiliser une seringue de 50 ml à injecter l'encre de Chine dans les poumons par la trachée. Complètement gonfler les poumons avec de l'encre jusqu'à ce que vous sentez une forte résistance.
5. Utilisez des ciseaux pour couper la trachée. Faites glisser une paire de pinces dans les poumons et les sortir de la souris. Rincez les poumons brièvement dans un bécher de 1 litre d'eau.
6. Dans une hotte, le transfert des poumons à un flacon à scintillation en verre contenant 5 ml de solution de Fekete. Le tissu tumoral va s'imposer comme des nodules blancs sur les poumons noirs après quelques minutes. Les tumeurs peuvent maintenant être comptés et enregistrés dans une solution de Fekete indéfiniment.

4. Métastases Représentant en Poumons visualisé

1. Ici, les poumons des souris qui ont été injectés avec 4T1 carcinome mammaire lignée cellulaire montrent des taches blanches indiquant les tumeurs. Les souris qui ont été injectées avec des cellules 4T1 transfectées avec un IRF8 dominante-négative K79E mutant montrer le potentiel améliorée métastatique des cellules tumorales.
2. Ces images montrent une analyse histologique de l'efficacité de l'immunothérapie adoptive de transfert de CTL. Souris porteuses de tumeurs injectées avec une solution saline a montré de multiples tumeurs 6 jours plus tard, indiquées par des flèches jaunes (A). Souris injectées avec des cellules T spécifiques de la tumeur, d'autre part, a montré une réduction de tumeurs (B).
3. Dans la même expérience, le traitement encre de Chine donne un moyen plus simple pour mesurer l'efficacité du transfert adoptif de CTL. Ici, les nodules tumoraux blanc sur porteurs de tumeurs des poumons clairement les distinguer des poumons qui ont subi avec succès le transfert adoptif de CTL, et en comptant les nodules permet un degréde quantification n'est pas possible avec l'histologie.

5. Les résultats représentatifs

Figure 1. Dispositif expérimental pour la métastase des tumeurs expérimentales et de transfert de CTL adaptative immunothérapie modèle de souris. Les points rouges indiquent les cellules tumorales et des points verts indiquent les CTL.

Figure 2. Perturbation des fonctions améliorées IRF8 le potentiel métastatique des cellules tumorales. Mammaire de souris 4T1 carcinome ligne a été transfectées de façon stable avec le vecteur (4T1.Vector) ou vecteur exprimant une IRF8 mutant dominant négatif K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). Les cellules tumorales ont été injectées dans les veines de souris iv latérale de la queue. Porteurs de tumeurs des poumons étaient gonflés à l'encre de Chine de visualiser des nodules tumoraux. Nodules tumoraux sont facilement considérées comme des taches blanches sur le fond noir du tissu pulmonaire.

Figure 3. L'analyse histologique de l'efficacité de l'immunothérapie adoptive de transfert de CTL. Lignée cellulaire de souris sarcome de CMS4-Met a été injecté dans les veines de souris iv latérale de la queue. Trois jours plus tard, une solution saline (A) ou spécifiques d'une tumeur des cellules T (B) ont été injectées dans des souris porteuses de tumeur. Poumons ont analysé six jours après le traitement de CTL par coloration H & E conventionnels histologique. Nodules tumoraux sont indiquées par des flèches.

Figure 4. Visualisation des nodules tumoraux par l'inflation encre de Chine. Lignée cellulaire de souris sarcome de CMS4-Met a été injecté dans les veines de souris iv latérale de la queue. Trois jours plus tard, une solution saline (contrôle) ou une tumeur des cellules T spécifiques (+ CTL) ont été injectées dans des souris porteuses de tumeur. Poumons ont été analysés quatorze jours après le traitement de CTL. Les taches blanches, qui sont des nodules tumoraux, permettant la quantification aisée de l'efficacité du traitement de CTL.