斑马鱼幼虫的研究急性肾损伤的静脉Microinjections

Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079, doi:10.3791/2079 (2010).

（汉努瑶等人，2005）和（温斯坦等，1995），稍作修改报告公布的方法是基于以下协议的一部分。

第1部分：Microinjections

在预先设定为显微注射

• 鱼注射受精后（DPF）第2天。因此，成年斑马鱼繁殖了3晚，前有计划的实验。收集胚胎，并将其放置在培养皿E3的水（5MM氯化钠，0.17mM KCL，0.33mM _氯化钙 2，0.33mM _硫酸镁 4）为28.5 ° C 。在第一天结束的死胚取出培养皿和独立的胚胎，以便有80-100％培养皿中的胚胎。
• 准备从毛细管的长度，外径0.63 / 0.20 /身份证毫米（mm）的R - 6自定义玻璃管德拉蒙德科学公司，Broomall，扩音9-000-3000（4英寸）电极拉马拉的玻璃针。尖端直径应为10-20微米。 （徕卡S6E）在解剖显微镜下，画出一个永久性标记沿针约101毫米线，与统治者的帮助，并储存在一个大培养皿粘土斜针。
• 准备拿着吸管：消防波兰的一个薄壁硼硅玻璃毛细管（152毫米，外径1 / 0.75 /内径mm TW100 - 6，世界精密仪器公司）的提示，直到内径在本生灯火焰提示是0.4-0.5毫米。这种尺寸允许2 DPF斑马鱼幼虫卵黄囊良好的抓地力。举行一次的一块玻璃毛细管用长镊子，热与毛细管本生灯相反的一角，放置淡蓝色的火焰的内锥，最热的部分，它为1-2秒垂直年底，滚动它来获取一个均匀的熔体。这几次重复，然后在显微镜下研究的毛细血管，在舞台上微米（病区的94 W 9910）。这是关键的一步，它可能是必要的消防波兰少数控股移液器，并选择适当的大小后，当你操纵的幼虫。如果你细心的话，一个拿着吸管持续多个显微注射会议。
• 填写Microsyringe与矿物油的手动泵（MMP，世界精密仪器公司），按照制造商的指示。操纵杆操纵（Narishige，MN - 151），带有磁性的立场（151）Narishige，MN铁板（Narishige，IP）的连接，吸液管插入持有人。

显微注射

• 准备注射液20μL：2.4μl庆大霉素（Sigma - Aldrich公司G8648在盐溶液中，50mg/ml）和17.6μl10 - kDa的路西法黄色右旋糖酐（Invitrogen公司的D1825，（盐水1mg/ml的），在控制鱼庆大霉素盐水代替。荧光葡聚糖（可用于许多不同的颜色），足以证明注射的准确性和选择已注入nephrotoxicant的幼虫。
• 准备用2ml矿物油230毫米培养皿放置下注射混合和控制混合，以防止蒸发的解决方案。
• 准备麻醉：400毫克tricaine粉（乙基- M -氨基磺酸SIGMA A - 5040）97.7毫升2.1毫升1M​​三（DD水，pH值9）。调整pH至7。存放在冰箱原液，4.2毫升分装。作为麻醉剂稀释4.2毫升tricaine的原液的E3在100毫升水（韦斯特1993年），在室温下离开tricaine。

下面的步骤是在解剖显微镜下进行

• 手动删除任何chorions其余用细镊子和麻醉传输与tricaine培养皿的斑马鱼，在室温下回暖。斑马鱼应暴露在tricaine开始microinjections前至少15分钟。
• 打开使用刀片（VWR科学55411-050）注射针的尖端。保持在一个很小的角度，创建一个斜角切提示，如获得尖端直径约10 -20μm的开放的刀片。
• 打开电源，真空和空气中的微量注射器具（世界精密仪器公司，PV820气动picopump）供应。插入针持针器安装在倾斜的显微和基地（字精密仪器有限公司，型号M3301R，TB - 1）。
• 为了填补针，放置一个液滴的解决方案，在注入充满矿物油（费舍尔化工，0121-1）30毫米的Petri菜（10μL）。打开手动显微淹没针尖端的解决方案中，设置了picopump“保持/发泄”切换到“发泄”（相当于真空的PV820的“发泄”），并填写拉针通过针尖的解决方案。这将需要几分钟的时间，如果进针的解决方案变得太快，这意味着，尖端直径太大，并注射将不准确。针后已被填补，设置picopump“持有”（“持有”，等于注入的PV820）。
• 要校准针，设置的picopump“门控/定时”开关“门”，按下脚踏开关，放电针，并记录为半月板所花费的时间（秒）之一标志着未来（1毫米的总距离）。重复3次，取平均时间（以秒计），除以30（相当于1毫米的直线距离量在纳升（NL））的值，以确定提供的解决方案1 ​​NL所需的毫秒数。范围期间旋钮调整到这个号码，移动的“门控/定时”开关“定时”。现在，picopump是提供一个解决方案1nl脉冲。
• 卸下的矿物油碟和位置的培养皿，在显微镜下的幼虫。集团在培养皿的中心和重点的鱼。
• 广场对面的微量移液器手动microsyringe泵控股（MMP，世界精密仪器），推进其尖端的培养皿中，并进入显微镜的重点平面。一个很浅的角度弯曲，使拿着吸管很尖接触到培养皿的底部，是接近水平。确保不系统中的任何气泡，这将缓慢的响应时间和降低MMP的精度。
• 切换到一个更高的放大倍率的显微镜和使用手柄（特德佩拉113）超细睫毛位置非常接近拿着吸管与蛋黄仔鱼背侧。握住控股吸管吸吮逆时针旋转测微驱动器，控制手动microsyringe泵蛋黄仔鱼。小心不要打开微米太远，蛋黄可以爆拉进拿着吸管太深。重点上形成共同的大是大非的静脉，这是在蛋黄中，下方的周皮和是非常高血流量的站点。随着显微注射器具，引导到发展中国家的共同的大是大非静脉针。它通常是必要的拉针，回位后插入一个的，为共同的大是大非静脉是很肤浅的。按脚踏注入的解决方案1nl，然后释放幼虫从控股吸管，并返回到胚胎水。这是关键的一步，尤其是第一次，因为它需要一定量的实践定位的鱼和钻机的吸力和压力的控制。如果胚胎的蛋黄是正确拿着吸管举行，它不会辊针进入。
• 为了验证显微注射的成功，显示器在路西法黄色右旋糖酐的荧光显微镜下的斑马鱼的心脏。路西法黄色在约20分钟后进入循环系统消散的心脏仍然可见，如果注入的肾毒性的解决方案是正确的注射2小时内，你会看到很少路西法黄色右旋糖酐注射部位的剩余。如果解决方案是在卵黄囊，当场路西法黄色右旋糖酐注射仍将在注射部位。 （图1）。鱼返回到E3介质。
• 注射后两天，幼虫发育为肾功能下降的后果（图2）心包水肿。

第2部分：固定和免疫与Na ⁺ / K ^{+ ATP酶}抗体（α- 6F）

• 4 DPF，10至154毫升玻璃小瓶中的幼虫斑马鱼（Weathon 225012），并解决他们在1毫升登特在室温下4小时（80％甲醇，20％DMSO）。
• 补充水分分级甲醇/ PBT（0.5％Tween20的PBS）系列，75:25 50:50，25:75，100％的PBT的胚胎，吹打的解决方案，并加入新的解决方案，以相同的小瓶（1毫升解决方案，每瓶），20分钟，在每一个解决方案。幼虫不应该暴露在空气中，留下一点点的解决方案，覆盖变化的解决方案时的幼虫。
• 删除PBT和3小时更换1毫升封闭液（PBS，用1％二甲基亚砜，0.5％Tween20，10％正常山羊血清），在4 ° C一个nutator。
• 转让在2毫升离心的幼虫。删除阻断血清取代300μL第一抗体孵育液（PBS与1％DMSO，0.5％Tween20，2％正常山羊血清）在4 ° C过夜，一个nutator。我们使用1:25稀释的单克隆的^{Na +} / K + ATP酶抗体（α- 6F，上清，发育研究杂交瘤细胞银行，爱荷华州）
• 删除的主要抗体，并与在室温下孵育液洗3 × 30分钟。
• 第二抗体（羊抗鼠CY3，杰克逊Immunoresearch Laboratories公司155-165-003）孵育，在孵育液稀释为2小时1:500RT。
• 与PBT 3 × 30分钟洗净。

第3部分：JB - 4塑料包埋

• 脱水通过梯度乙醇系列（50％，75％，95％，100％× 2）的组织，每步10分钟。
• 准备渗透解决方案：JB - 4嵌入解决方案的25毫升（Polysciences 0226A）和催化剂0.24克（Polysciences 02618）。催化剂溶于约20-30分钟，它需要一段时间。该解决方案可以被保存在4 ° C可高达至1个月。
• 倒出了100％的乙醇，并用塑料渗透液更换。将瓶肩4 ° C和允许渗透进行，直到幼虫沉入底部的玻璃小瓶。此过程通常需要大约30分钟。
• 嵌入协议：在解剖显微镜下的塑料成型杯托盘（Polysciences，公司16643A）。幼虫转移，以及渗透解决方案，以支付，到杯子。塑料嵌入媒体准备在一个小塑料管。我们通常嵌入在一次4-5鱼，每杯的鱼类之一。准备5-6毫升塑料嵌入嵌入解决方案，为每杯（120毫升），每毫升的渗透液加入35μl的JB - 4嵌入解决方案的“B”（Polysciences公司0226B）。为每毫升的渗透液中添加35μLJB - 4嵌入解决方案的“B”（Polysciences公司0226B）。拌匀，用塑料巴斯德吸管多次吹打向上和向下。这是很重要的，因为如果不充分混合JB - 4不会聚合正确。嵌入塑料5毫升已经准备后，各地巴斯德吸管样品中删除渗透塑料。填写嵌入塑料杯。必须软泥塑料杯，以确保良好的附着块持有人的标本。为了检测斑马鱼的肾小管，横截面是最好的。为此，嵌入式垂直鱼，低着头。处理或罚款钳睫毛的援助，定期垂直位置的鱼，直到塑料是努力不够，他们不从自己的立场。大约需要20-30分钟。然后，放置在杯EBH - 2座的持有人（Polysciences公司15899）和离开托盘在4 ° C过夜。当在完全聚合，可以弹出像冰块块。
• 替代嵌入多个幼虫协议：中途JB - 4完整填写的模具，并允许它聚合。为15平方毫米的模具，我们在使用700μlJB - 4卷，填补了模具的一半。接下来，添加固化剂JB - 4浸泡幼虫预聚合半满的模具。东方头指向模具的长边和对齐幼虫的幼虫，使眼球排队（你可以在一个单一模具在一条线上10鱼）。块聚合后，您可以减少块的边缘，打开它，让面朝刀和一个塑料的“夹头”，适合在切片强力胶。使用这种方法，你可以定位在相同的块，在塑料为中心，截面准备大量幼虫。护理已采取定向刀块，所以，相当于每条鱼单节。这可以通过眼睛来完成，而切片：即东方块，使每条鱼的眼睛相当于部分。最终的结果是，你就可以分析在一台显微镜玻片上的许多鱼随之而来。

第4部分：切片

• 设置成标本的切片机夹头的持有人（我们用一个Shandon Finesse的热电子公司切片）
• 设置幻灯片回暖至45 ° C。
• DI水倒入一个烧杯中，并把它关闭的切片
• 在切割之前，确保导向块，如鱼以获得完美的横截面。方向头调整杠杆，可以使旋转位置标本头准确地刀。开始切割厚的部分通过鱼嘴。东方块切片，通过眼睛，使眼睛相当于部分是为每条鱼。当胸鳍出现的部分，就是当pronephric管开始。从这一点来说，削减约32 4块UM部分。
• 用镊子收集的部分，并让他们不接触水钳，与水的烧杯中放入。节将扩大尽快到达水面，现在你可以在幻灯片上收集。在45度角插入水中幻灯片和方法帮助睫毛与处理的部分，感人的部分边界。
• 孵育的幻灯片，幻灯片上，直至完全干燥温暖。
• 使用啶或共聚焦显微镜的图像部分。

第5部分：代表ULTS

当正确执行，注入鱼出现类似图1，与小荧光葡聚糖（在这种情况下路西法黄河）在心脏和循环系统可见。如果注射过深，注入的材料可以看出集中在卵黄囊，或心脏被刺破导致失血过多。如果拿着吸管是正确的，鱼不会滚动或移动注射时，这将允许更精确的注射。此外，它的重要，以确保不会有任何气泡，在MMP将缓慢的响应时间和降低系统的精度。一般来说，由于庆大霉素的肾毒性的结果，80％的注射鱼发展心包水肿（图2）。我们使用一种表型为基础的分类系统，中度水肿鱼表现出明显的心包的水肿，但没有其他人观察到的表型，而严重水肿鱼显示有轻微的心包和躯干的水肿，中度轴曲率。使用肾小管抗体对娜一个⁺ / K ⁺ ATP酶（α- 6F），我们可以想像损坏管，横截面具有明显的损失相比，对照组（图3）损坏肾小管细胞极性和肾小管破坏。这种模式是通过多个横截面一致的。为了获得完美肾小管的横截面是很重要的正确位置在嵌入的鱼。比较路段时，胸鳍和近曲小管被用作解剖标记。

图1。Nephrotoxin显微注射。 （一）成功的一个10kDa右旋糖酐注射结合路西法黄色，淡淡的表达，在共同的大是大非静脉，白色箭头。 （二）不正确的注射，在10kDa右旋糖酐的存款共轭路西法的黄色，不会消散进入循环系统，红色箭头。

图2。庆大霉素介导的水肿。 （一）控制注入了幼虫的斑马鱼。 （二）中度或（C）重度水肿，庆大霉素注射幼虫的斑马鱼。所有的幼虫都在4 DPF前左和背。黑色箭头指向B和C心包水肿

图3。AKI的免疫组化。 α- 6F的^{Na +} / ^{K + ATP酶}的48小时后庆大霉素注射液（4 DPF幼虫）控制在（A，B）和庆大霉素注射（C，D）的幼虫的抗体染色。 A，C，20X放大倍率，B和D是正确的肾小管基底极性和肾小管破坏，白色箭头，在D，A和C注意的损失3倍数码放大倍率相比到B。

在这个视频文章中，我们展示了AKI的模型静脉显微注射技术，通过创建庆大霉素介导斑马鱼幼虫近端肾小管损伤。这种损害结果心包和/或严重水肿的形成，反映了无法调节水的平衡。我们还描述了一个标志着分化肾小管（马宗达等，2000）的一种抗体，免疫组织化学实验，显示损坏肾脏的肾小管上皮细胞极性和中断的损失。静脉microinjections代表到斑马鱼幼虫的血液提供一种可溶性物质的有效方法。这项技术是引进的多种物质的一个极好的工具，并用一种​​荧光标记统一注射的帮助，可反复多次超过允许一致的结果。

没有利益冲突的声明。

这项工作是由美国国立卫生研究院（NIH）的赠款R01DK069403和P30DK079307研究院的资助。

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