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 JoVE Neuroscience

अलगाव, संवर्धन, और medulloblastoma स्टेम सेल के रखरखाव

, , ,

Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University

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Cite this Article: अलगाव, संवर्धन, और medulloblastoma स्टेम सेल के रखरखाव

Huang, X., Ketova, T., LItingtung, Y., Chiang, C. Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells. J. Vis. Exp. (43), e2086, doi:10.3791/2086 (2010).

Protocol: अलगाव, संवर्धन, और medulloblastoma स्टेम सेल के रखरखाव

1. ट्यूमर असर सेरिबैलम के लघु विच्छेदन, ट्यूमर ऊतक और चढ़ाना के पृथक्करण

  1. ट्यूमर ऊतक के रिट्रीवल
    1. बीमार चूहों असर medulloblastoma अक्सर runted थे, hydrocephaly और पीछे पक्षाघात और जब पलट मुद्रा हासिल विफलता सहित विशिष्ट स्नायविक लक्षण, का प्रदर्शन किया. ट्यूमर ऊतक पुनः प्राप्त करने के लिए, कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना द्वारा चूहों euthanize. यह महत्वपूर्ण है के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था, एक प्रक्रिया है कि पीछे खोपड़ी के लिए दबाव उत्पन्न करता है और ट्यूमर के ऊतक की अखंडता समझौता कर सकते हैं प्रदर्शन नहीं है.
    2. शिरच्छेद कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर मौत के बाद तुरंत किया जाता है, अच्छा दृश्य के लिए खोपड़ी के बाल और मांसपेशियों के ऊतकों जितना संभव को हटाने. 95% इथेनॉल के साथ भिगो Kimwipe साथ खोपड़ी की सतह को साफ करें.
    3. ठीक कैंची का उपयोग करने के लिए खोपड़ी के midline साथ एक खोलने में कटौती, और खोपड़ी ठीक चिमटी का उपयोग कर, जो बिंदु पर ट्यूमर असर सेरिबैलम सहित पूरे दिमाग उजागर ऊतक निकालने.
    4. जबकि स्वस्थ वयस्कों के cerebella अच्छी तरह से परिभाषित गोलार्द्धों और vermis प्रदर्शन, ट्यूमर असर चूहों के cerebella अक्सर बढ़े, एक चिकनी सतह और विशिष्ट रक्त वाहिकाओं के साथ आकारहीन. बाँझ तकनीकों का प्रयोग, अनुमस्तिष्क ट्यूमर ठंडा पीबीएस में Mg2 बिना चिमटी और जगह का उपयोग कर निकालते हैं और 2 Ca + +.

    नोट: सभी उपकरणों के उपयोग करने से पहले 95% इथेनॉल में निष्फल रहे हैं.
  2. ट्यूमर ऊतक की हदबंदी
    1. पीबीएस से 50% (पीबीएस में पतला) Accutase कि ट्यूमर ऊतक की मात्रा के बारे में 4 बार है ट्यूमर ऊतक स्थानांतरण, 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए ठीक कैंची, 37 पर ऊष्मायन द्वारा पीछा ° C के साथ ऊतक कीमा , जिसके बाद अतिरिक्त 3 मिनट के लिए 1-एमएल Pipetman ऊतक के साथ दोहरावदार pipeting आए. इस विधि एकल कक्षों और छोटे सेलुलर समुच्चय का एक मिश्रण की उपज चाहिए.
    2. 5 मिनट 1000 ग्राम में गोली कोशिकाओं के लिए सेलुलर निलंबन पीबीएस के साथ 3 गुना और अपकेंद्रित्र पतला. एक gelatinized 60 मिमी Primaria टिशू कल्चर पकवान पर नए सिरे से तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति माध्यम और प्लेट में सेल गोली Resuspend. हम पहले चढ़ाना पर बढ़ाया लगाव लिए Primaria व्यंजन का उपयोग करें, बाद मार्ग नियमित रूप से टिशू कल्चर व्यंजन पर चढ़ाया जा सकता है.

नोट: 0.1 कम से कम 30 मिनट के लिए जिलेटिन% के साथ कोट संस्कृति बर्तन. ताजा तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति glutamine, पेन Strep, N2, B27, मानव EGF (25 एनजी / एमएल) और बुनियादी FGF (25ng / एमएल) के साथ Neurobasal माध्यम से मिलकर मध्यम तैयार.

2. संवर्धन, रखरखाव, और medulloblastoma ट्यूमर कोशिकाओं के सीरियल Passages द्वारा विस्तार

हम आम तौर पर प्रारंभिक चढ़ाना (चित्रा 1) के 1 सप्ताह के बाद कई कालोनियों को मिलता है. इन कालोनियों dissociated और ट्यूमर सेल की आबादी के संवर्धन के लिए नए gelatinized व्यंजन पर replated किया जा सकता है. नई संस्कृति के माध्यम से पहले बदलने के लिए, तो बस एक 1 एमएल Pipetman उपयोग यंत्रवत् 4 मिनट के लिए दोहरावदार pipeting द्वारा पीछा करने के लिए एक सेलुलर निलंबन (कोई Accutase जरूरत) उपज कालोनियों अलग. एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि बड़े सेल clumps dissociated किया गया है. फिर नए gelatinized व्यंजन पर आगे संवर्धन के लिए सेल निलंबन और बग़ैर अतिरिक्त मार्ग के लिए एक ही प्रक्रिया के माध्यम से जाना. स्वाधीन ट्यूमर कोशिकाओं, रक्त कोशिकाओं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं धारावाहिक पुनः platings द्वारा हटा रहे हैं, संलग्न ट्यूमर कोशिकाओं के तेजी से विस्तार करने के लिए छोड़ने. संस्कृति प्रारंभिक बोने के बाद दूसरे दिन, मध्यम, और उसके बाद हर दूसरे दिन बदलें.

3. Immunofluorescent धुंधला और संवर्धित कोशिकाओं की परीक्षा

1. कांच coverslips पर ट्यूमर कोशिकाओं को विकसित

1 दिन, 6 अच्छी तरह से एक थाली के प्रत्येक जगह एक गिलास coverslip में, तो 37 में 0.1% 30 मिनट के लिए जिलेटिन डिग्री सेल्सियस जोड़ने बीज लगभग 2-4X 10 एमएल प्रति 5 ट्यूमर कोशिकाओं. कोशिकाओं रात भर देते हैं और तंत्रिका स्टेम सेल मध्यम 3 दिन बदल जाना चाहिए. धुंधला 4 दिन पर किया जाता है.

2 Immunofluorescent धुंधला

पीबीएस ठंडा के साथ संस्कृति मध्यम और धोने कोशिकाओं में दो बार निकालें. 15 मिनट के लिए ताजा किया 4% पीएफए ​​के साथ कोशिकाओं को ठीक. संक्षेप में कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धोने और 5 मिनट के लिए 0.3% ट्राइटन (पीबीएस में) के साथ permeablize. संक्षेप में कोशिकाओं को दो बार 40 मिनट के लिए 10% बकरी सीरम के साथ पीबीएस और ब्लॉक के साथ धो. 90 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, तो कोशिकाओं को प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार, धोने. 60 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, तो पीबीएस साथ तीन बार धोकर, 5 मिनट प्रत्येक. एक जलीय बढ़ते माध्यम से 5 एमएल के साथ स्लाइड्स पर coverslips पर्वत और confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन.

4. ट्यूमर कोशिकाओं के भेदभाव

पता निकालेंeural स्टेम सेल मध्यम और संक्षेप में पीबीएस के साथ कोशिकाओं में दो बार धोने. 1 दिन पर भेदभाव मध्यम जोड़ें, 4 दिन मध्यम परिवर्तन और 7 दिन immunofluorescence धुंधला द्वारा भेदभाव के स्तर का निर्धारण. भेदभाव मध्यम DMEM, पेन - Strep और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के होते हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम

आकृति विज्ञान के परिणाम

Accutase उपचार और कोमल दोहराव pipeting के बाद, ट्यूमर ऊतक ज्यादातर छोटे सेलुलर समुच्चय और एकल कक्षों में अलग होना चाहिए. कई बड़े आकार कालोनियों के प्रारंभिक चढ़ाना के बाद 5 दिन के रूप में में जल्दी के रूप में मनाया जा सकता है, के रूप में चित्रा 1 के द्वारा दिखाया गया है. अति proliferative ट्यूमर कोशिकाओं अक्सर उच्च परमाणु / cytoplasmic अनुपात के साथ द्वि - ध्रुवीय कर रहे हैं. इन कोशिकाओं को आम तौर पर छोटे सेलुलर gelatinized सतह को संलग्न समुच्चय से radiating देखा जाता है. रक्त कोशिकाओं, छोटे और गोल, आमतौर पर बाद में मीडिया में परिवर्तन और धारावाहिक platings द्वारा हटा रहे हैं. कई मार्ग के बाद, एक का पालन कर सकते हैं समान रूप से वितरित, proliferative Ki67 + ट्यूमर कोशिकाओं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं (चित्रा 2) के साथ थोड़ा संदूषण.

तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर, clonal विश्लेषण और कई प्रजातियों में भेदभाव की अभिव्यक्ति

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या proliferative कोशिकाओं dissociated अनुमस्तिष्क ट्यूमर स्टेम कोशिकाओं के ट्यूमर ऊतक शो विशेषताओं से व्युत्पन्न, हम स्टेम सेल मार्कर अभिव्यक्ति, clonal विश्लेषण और भेदभाव शक्ति से आगे लक्षण वर्णन प्रदर्शन किया. हमने पाया है कि इन अलग ट्यूमर कोशिकाओं को अत्यधिक Sox2 और Nestin (चित्रा 3) के रूप में तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर व्यक्त. जैसा कि हम SmoM2 YFP ट्यूमर से ऊतकों को पुनः प्राप्त है, सभी ट्यूमर कोशिकाओं व्यक्त YFP. हाल ही में एक अध्ययन के साथ कि प्राथमिक cilia रिपोर्टिंग अनुरूप श्श्श मार्ग पर निर्भर 12 medulloblastoma, SmoM2 YFP अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से Sox2 के cilia + ट्यूमर कोशिकाओं (चित्रा 3) के लिए स्थानीयकृत किया गया था के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं. जब मध्यम संस्कृति के एमएल प्रति 300 कोशिकाओं के clonal घनत्व पर चढ़ाया, हम एक ही ट्यूमर कोशिका से एक बड़ा कॉलोनी (चित्रा 4) के लिए clonal विस्तार मनाया. इसके अलावा, इन कोशिकाओं विभिन्न neuronal और glial सेल प्रकार में अंतर जब समर्थक भेदभाव शर्तों (चित्रा 5) के तहत सुसंस्कृत करने में सक्षम थे.

चित्रा 1
चित्रा 1. आकृति विज्ञान dissociated medulloblastoma ऊतक के पहले चढ़ाना के बाद एक उच्च proliferative कॉलोनी के . आम तौर पर, dissociated ट्यूमर ऊतक के प्रारंभिक बोने के बाद 5 दिन, और एक प्रतिनिधि से एक के भीतर एक बड़ा कॉलोनी रूपों यहाँ उज्ज्वल क्षेत्र में सचित्र है. द्वि - ध्रुवीय, एक घने कोर सेल कुल से लम्बी कोशिकाओं विकीर्ण. ट्यूमर कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए कर रहे हैं छोटे, गोल लाल रक्त कोशिकाओं है, जो धीरे - धीरे धारावाहिक platings द्वारा समाप्त हो रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. तीन मार्ग से परे की स्थापना की medulloblastoma कोशिकाओं की आकृति विज्ञान. यह उज्ज्वल क्षेत्र छवि कई मार्ग के बाद स्थापित medulloblastoma कोशिकाओं की विशिष्ट उपस्थिति से पता चलता है. कोशिकाओं ज्यादातर उच्च अनुपात / परमाणु cytoplasmic के साथ द्वि - ध्रुवीय रहते हैं. हम ट्यूमर कोशिकाओं के acetylated ट्यूबिलिन धुंधला दिखाने के लिए, जिनमें से ज्यादातर साइकिल चालन के रूप में मजबूत Ki67 अभिव्यक्ति द्वारा दिखाया गया है.

चित्रा 3
चित्रा 3. स्थापित medulloblastoma कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर व्यक्त करते हैं. SmoM2 YFP constitutively सक्रिय SMO, इसलिए श्श्श मार्ग गतिविधि व्यक्त कोशिकाओं के निशान. स्थापित medulloblastoma सेल लाइनों की सभी कोशिकाओं YFP व्यक्त की, और उनमें से ज्यादातर विभिन्न Nestin और Sox2 जैसे तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर, उच्च स्तर के सह व्यक्त की. दिलचस्प है, जब हम कम से कम शक्ति के साथ लेजर confocal माइक्रोस्कोपी के दौरान YFP संकेत का पता लगाने के प्रदर्शन, हम Sox2 + कोशिकाओं की cilia में केंद्रित YFP संकेत का पता चला. यह अवलोकन है कि cilia के श्श्श medulloblastoma मार्ग पर निर्भर के विकास में आवश्यक भूमिका का वर्णन हाल ही में एक रिपोर्ट 12 के साथ संगत है.

चित्रा 4
चित्रा 4. स्थापित ट्यूमर कोशिकाओं क्लोनल विस्तार से गुजरना. हदबंदी के बाद एकल कक्ष निलंबन में, ट्यूमर कोशिकाओं को अच्छी तरह से थाली 24 पर मध्यम संस्कृति के एमएल प्रति 300 कोशिकाओं के एक clonal घनत्व पर चढ़ाया गया. प्रत्येक अच्छी तरह से हम clonally विस्तार कालोनियों मनाया. उज्ज्वल क्षेत्र छवियों की यह श्रृंखला संस्कृति की एक 10 दिन की अवधि से अधिक विशिष्ट परिवर्तन प्रदर्शित करता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. स्थापित medulloblastoma कोशिकाओं के भेदभाव विश्लेषण करती है. जब ट्यूमर कोशिकाओं EGF / bFGF DMEM/10% FBS, YFP + ट्यूमर कोशिकाओं में काफी उनके आकारिकी बदल और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, कांग्रेस में भेदभाव करने के लिए सीरम मुक्त मध्यम युक्त से बदल रहे थेTuj1 luding + या NeuN + न्यूरॉन्स, GFAP + astroglial कक्षों या CNPase + oligodendrocytes.

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Discussion: अलगाव, संवर्धन, और medulloblastoma स्टेम सेल के रखरखाव

हम एक कुशल तरीका अलग, समृद्ध और medulloblastoma constitutively सक्रिय हाथी संकेतन के साथ उत्परिवर्ती चूहों से प्राप्त प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों से स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखने का वर्णन है. हमने पाया है कि सफलतापूर्वक एक स्वस्थ ट्यूमर स्टेम सेल लाइन स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण कदम Accutase प्राथमिक ट्यूमर ऊतक के पृथक्करण के दौरान इस्तेमाल किया उपचार है. हमारे अनुभव में, जब सेरिबैलम से पहले अलग ट्यूमर ऊतक, 50% 37 Accutase उपचार के 4 मिनट डिग्री सेल्सियस, दोहराव pipeting 3 मिनट 1-एमएल Pipetman का उपयोग आम तौर पर सफल पहली बोने में परिणाम होगा द्वारा पीछा किया. यह भी महत्वपूर्ण है के लिए प्रतीक्षा करने के लिए जब तक फिर से चढ़ाना (चित्रा 1) से पहले बड़े आकार कालोनियों का गठन कर रहे हैं. पहली बोने के बाद, Accutase उपचार आवश्यक नहीं रह गया है, 3-4 मिनट के लिए 1-एमएल Pipetman का उपयोग दोहराव pipeting हटाना और फिर से चढ़ाना के लिए सेल clumps अलग कर देना करने के लिए पर्याप्त है. छोटी मात्रा Pipetman उपयोग के रूप में बेहतर सुझावों कोशिकाओं बड़े पैमाने पर नुकसान होगा मत करो. एक सेल लाइन की स्थापना की प्रत्येक ट्यूमर ऊतक पृथक से उत्पन्न किया जा सकता है और इन कोशिकाओं को अत्यधिक proliferative हैं, robustly कई तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर व्यक्त करने और दोनों neuronal और glial सेल प्रकार में अंतर कर सकते हैं. हम इम्युनो - समझौता प्राप्तकर्ता चूहों जो बाद में माध्यमिक medulloblastomas विकसित में इन कोशिकाओं के प्रत्यारोपण orthotopic प्रदर्शन किया है. संस्कृति में इन ट्यूमर कोशिकाओं को शायद ही कभी सहज भेदभाव या apoptosis, विशेषताएं है कि neurosphere संस्कृति तरीकों के लिए आम कर रहे हैं प्रदर्शन किया. इस प्रोटोकॉल प्राथमिक medulloblastomas से व्युत्पन्न ट्यूमर स्टेम कोशिकाओं के सफल प्रचार के लिए डिज़ाइन किया गया है और इस प्रकार, हमें हाथी संचालित ट्यूमर सेल के विकास और व्यवहार पर उम्मीदवार जीनों और रासायनिक inhibitors के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए सक्षम हो जाएगा.

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Disclosures: अलगाव, संवर्धन, और medulloblastoma स्टेम सेल के रखरखाव

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements: अलगाव, संवर्धन, और medulloblastoma स्टेम सेल के रखरखाव

इस अध्ययन Vanderbilt-Ingram कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (CA068485 p30), बचपन ब्रेन ट्यूमर फाउंडेशन और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NS042205) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials: अलगाव, संवर्धन, और medulloblastoma स्टेम सेल के रखरखाव

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal medium Invitrogen 21103049
hEGF Invitrogen PHG0311 25ng/ml
bFGF Invitrogen PHG0023 25ng/ml
N2 Invitrogen 17502048 1X
B27(-RA) Invitrogen 12587010 1X
Accutase Invitrogen A1110501 50%
Gelatin Sigma-Aldrich G1393 0.1%
Glutamine Invitrogen 25030081 2mM
Primaria dishes Fisher Scientific 087724C
Sox2 antibody EMD Millipore MAB4343 Mouse, 1:1000
Nestin antibody DSHB rat401 Mouse, 1:200
YFP antibody Molecular Probes, Life Technologies A11122 Rabbit, 1:2000
GFAP antibody Neuromics CH22102 Chicken, 1:1000
Tuj1 antibody Sigma-Aldrich T5076 Mouse, 1:2000
NeuN antibody EMD Millipore MAB377 Mouse, 1:2000
CNPase antibody EMD Millipore MAB326 Mouse, 1:1000

References: अलगाव, संवर्धन, और medulloblastoma स्टेम सेल के रखरखाव

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