The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Department of Biochemistry, University of Toronto
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Kanjee, U., Houry, W. A. An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase. J. Vis. Exp. (46), e2094, doi:10.3791/2094 (2010).
1) अभिकर्मकों और उपकरण
2) LdcI परख
3) TNBS रिएक्शन और रंग विकास
4) प्रतिनिधि परिणाम
1) Cadaverine मानक वक्र (चित्रा 3)
परख के रूप में किसी भी एल lysine या LdcI बिना वर्णित है, लेकिन प्रदर्शन किया था और cadaverine के बजाय विभिन्न सांद्रता empirically परख के रैखिक श्रृंखला निर्धारित किया गया. 0.25 की एक 340 आयुध डिपो रैखिक परख थी, ~ cadaverine के 22 nmoles (चित्रा 3) करने के लिए इसी.
2 LdcI की गतिविधि) (चित्रा 4)
अकेले LdcI की गतिविधि के लिए 153.5 (18.1 ±) nmoles cadaverine मिनट 1 μg LdcI 1-6.5 पीएच. निर्धारित किया गया था 100 सुक्ष्ममापी GTP या सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी) की उपस्थिति में LdcI की गतिविधि अप्रभावित है, लेकिन दृढ़ता से pppGpp और ppGpp (चित्रा 4) की उपस्थिति में हिचकते हैं (> 10 गुना).
चित्रा 1. LdcI प्रतिक्रिया के योजनाबद्ध आरेख. एल lysine decarboxylation प्रतिक्रिया के लिए सीओ 2 और cadaverine उत्पन्न के रूप में उच्च pH पर TNBS के साथ बाद में प्रतिक्रिया के रूप में अच्छी तरह से दिखाया गया है एन, N'- bistrinitrophenylcadaverine (TNP cadaverine ) और एन, एन उत्पन्न 'bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine). फ़ान एट al.11 पर आधारित
चित्रा 2. Eppendorf थर्मोस्टैट के सेटअप 24 अच्छी तरह Eppendorf थर्मोस्टेट में नमूने के लेआउट के साथ परख के इस कदम का वर्णन (बोल्ड में संकेत) के साथ दिखाया गया है. तीर प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल के अनुसार समाधान के हस्तांतरण से संकेत मिलता है. 96 अच्छी तरह से थाली में स्थान पर समाधान करने के लिए प्रतिक्रिया समाधान के हटाना भी संकेत दिया है.
चित्रा 3. Cadaverine मानक वक्र. Cadaverine के nmoles बनाम 340 एनएम पर absorbance के एक भूखंड दिखाया गया है. त्रुटि सलाखों के कम से कम तीन स्वतंत्र मापन के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. सबसे अच्छा फिट की लाइन भी दिखाया गया है .996 के एक R2 है.
चित्रा 4. LdcI परख परिणाम है. LdcI गतिविधि की दर के एक साजिश (nmoles cadaverine में न्यूनतम 1 - μg 1 LdcI उत्पादित) 100 सुक्ष्ममापी GTP, सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी), pppGpp, ppGpp की उपस्थिति में और nucleotide के अभाव में दिखाया है . कड़े प्रतिक्रिया (पी) न्यूक्लीओटाइड्स ppGpp काफी बाधा LdcI गतिविधि करने में सक्षम हैं. त्रुटि सलाखों से कम से कम छह स्वतंत्र माप के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं.
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Lysine decarboxylase परख में, TNBS एल lysine और cadaverine के प्राथमिक amines के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है TNP-lysine और TNP-cadaverine adducts (चित्रा 1) के रूप में. TNP-lysine पर carboxylic एसिड समूह की उपस्थिति के कारण, इस adduct पानी में घुलनशील रहता है, जबकि TNP-cadaverine, carboxylic एसिड समूह की कमी, 11 टोल्यूनि में विभाजन करने में सक्षम है. परख के इस प्रकार के अन्य प्रकार के अमीनो एसिड जहां एक carboxylic एसिड समूह की हानि प्रतिक्रिया के दौरान होता है है पर अधिक मोटे तौर पर उपयोग कर सकते हैं. यह inducible ओर्निथिन decarboxylase SpeF द्वारा एल ओर्निथिन decarboxylation polyamine 7 putrescine और inducible arginine decarboxylase AdiA द्वारा एल arginine के decarboxylation फार्म polyamine 4 agmatine फार्म के दौरान होता है है .
LdcI परख यहाँ वर्णित इन विट्रो में शुद्ध प्रोटीन की गतिविधि के निर्धारण के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से विधि प्रदान करता है. इस परख के बड़े फायदे हैं:
i) एकाधिक का उपयोग प्रतिकृति प्रति प्रत्येक माप के सटीक प्रयोग में सुधार;
ii) परख प्रोटोकॉल के संशोधन के बिना बफर स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला (अलग पीएच, नमक, आदि एजेंट को कम करने) पर आयोजित किया जा सकता है;
iii) परख LdcI के vivo गतिविधि में सेल के विकास के दौरान excreted cadaverine की राशि का निर्धारण करके मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
इस परख के प्रमुख सीमाएं हैं:
मैं) प्रयोगों की संवेदनशीलता TNP-adducts के absorbance के रैखिक रेंज द्वारा सीमित हैं;
ii) एकाधिक प्रसंस्करण कदम प्रयोगात्मक त्रुटियों की भयावहता को बढ़ाने;
iii) नहीं सभी एमिनो एसिड decarboxylases प्रोटोकॉल के इस प्रकार के के लिए उत्तरदायी हैं. उदाहरण के लिए, inducible glutamic एसिड decarboxylases द्वारा decarboxylation / एल glutamic एसिड के GadA GadB γ अमीनो butyric एसिड, 2 TNBS adduct जिसमें से पानी में घुलनशील पक्ष श्रृंखला carboxylic एसिड की उपस्थिति की वजह से हो जाएगा उत्पन्न समूह.
ई. के एसिड तनाव प्रतिक्रिया के जैव रासायनिक जांच कोलाई अनुसंधान के एक विस्तार क्षेत्र है और हमें बेहतर ई. में तनाव प्रतिक्रिया के आणविक आधार को समझने के लिए अनुमति देगा कोलाई और संबंधित γ-proteobacteria है कि इसी तरह साल्मोनेला enterica serovar 12 typhimurium और विब्रियो हैजा 13 जैसे एसिड तनाव प्रतिक्रिया प्रणाली है . खोज की है कि LdcI गतिविधि कड़े प्रतिक्रिया नियामक ppGpp से हिचकते है इस प्रोटीन के नियमन में एक पहले से अज्ञात अंतर्दृष्टि के साथ हमें प्रदान की गई है.
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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
हम हमें जीवाणु उपभेदों, plasmids, और आवश्यक प्रोटोकॉल भेजने के लिए धन्यवाद डॉ. डॉ. माइकल Cashel (स्वास्थ्य, बेथेस्डा, MA, संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थानों). हम SpecraMax प्लेट पाठक के उपयोग के लिए डॉ. जॉन ग्लोवर (जैव रसायन विभाग, टोरंटो विश्वविद्यालय के) धन्यवाद. ब्रिटेन के एक राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा के स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति () NSERC, स्ट्रक्चरल बायोलॉजी में रोग से जुड़ा झिल्ली प्रोटीन के एक संस्थान कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान सामरिक प्रशिक्षण कार्यक्रम, और टोरंटो ओपन फैलोशिप के एक विश्वविद्यालय के प्राप्तकर्ता है. इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा वाह (एमओपी 67,210) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| Cadaverine | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt Ltd | ||
| 96-well quartz plate | Hellma | ||
| VWR Digital Heatblock | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
