वायुमंडलीय दबाव LAESI मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा जैविक ऊतकों और Biofilms के आण्विक इमेजिंग

Nemes, P., Vertes, A. Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (43), e2097, doi:10.3791/2097 (2010).

परिवेश ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री में तरीकों विश्लेषणात्मक जांच देशी की तरह प्रयोगात्मक शर्तों के अधीन ऊतक या biofilm पर सीधे प्रदर्शन की अनुमति देते हैं. लेजर पृथक electrospray ionization (LAESI) एक प्रकार का विकास है और युक्त पानी के नमूनों की जांच के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है. LAESI मध्य अवरक्त एक लेजर बीम (2.94 सुक्ष्ममापी तरंगदैर्ध्य) का इस्तेमाल करने के लिए नमूने के पानी के अणुओं उत्तेजित. जब पृथक प्रभाव दहलीज पार है, नमूना सामग्री बात कण के रूप में निष्कासित कर दिया है और इन प्रोजेक्टाइल नमूना की सतह के ऊपर मिलीमीटर के दसियों के लिए यात्रा. LAESI में इस पृथक पंख उच्च आरोप बूंदों से रोक निकली नमूना सामग्री के एक अंश पर कब्जा करने के लिए और गैस चरण आयनों में अपने रासायनिक घटक कन्वर्ट. एक मास स्पेक्ट्रोमीटर एक वायुमंडलीय दबाव आयन स्रोत अंतरफलक के साथ सुसज्जित जारी नमूने के जांच क्षेत्र (पिक्सेल) से प्रारंभिक आयनों की संरचना का विश्लेषण और रिकॉर्ड करने के लिए कार्यरत है. पिक्सल के एक सरणी में एक व्यवस्थित पूछताछ microprobe विश्लेषण मोड में आणविक इमेजिंग के लिए एक रास्ता खोलता है. LAESI जन spectrometric इमेजिंग का एक अनूठा पहलू गहराई रूपरेखा है कि पार्श्व इमेजिंग के साथ संयोजन में, तीन आयामी (3 डी) आणविक इमेजिंग के लिए सक्षम बनाता है. ~ 100 सुक्ष्ममापी और ~ 40 सुक्ष्ममापी, क्रमशः की वर्तमान पार्श्व और गहराई संकल्प के साथ, LAESI जन spectrometric इमेजिंग जैविक ऊतकों की आणविक संरचना का पता लगाने में मदद करता है. इस के साथ साथ, हम एक LAESI प्रणाली के प्रमुख तत्वों की समीक्षा करने और एक सफल इमेजिंग प्रयोग के लिए दिशा निर्देश प्रदान.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल लेजर पृथक electrospray ionization (LAESI) प्रयोग के प्रमुख चरणों का वर्णन करता है और पौधे और पशु के ऊतकों के नमूनों के लिए पार्श्व और तीन आयामी (3 डी) इमेजिंग के लिए प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान करता है है. अतिरिक्त प्रयोगात्मक और तकनीकी जानकारी कहीं और से प्राप्त किया जा सकता ^है 1-6 .

1. ऊतक तैयारी और बढ़ते

1. यदि सेक्शनिंग की जरूरत है, अनुभाग के लिए एक cryomicrotome ऊतक -10 में 10-100 सुक्ष्ममापी मोटी स्लाइसें में उपयोग -20 डिग्री सेल्सियस जब तक अन्यथा एक विशेष ऊतक प्रकार के लिए सिफारिश की है.
2. रासायनिक संशोधक बिना सीधे एक फ्लैट सतह (जैसे, रासायनिक गिलास स्लाइड पूर्व साफ) पर वर्गों माउंट. Sectioned ऊतकों के लिए, वर्गों पिघलना माउंट और विश्लेषण के दौरान सभी समय पर जमे हुए ऊतक रखने पिघलना बढ़ते पर Peltier ठंडा करने के लिए एक मंच के लिए नमूना धारक तुरंत सुरक्षित. इस कदम के लिए कम से कम / अनुभाग में आणविक प्रवास को रोकने की जरूरत है.
3. यदि आवश्यक हो, एक गर्मी सिंक एक शक्ति कम करने के लिए Peltier मंच से गर्मी हटाने की सुविधा के लिए बनाए रखने के ऊतक जमे हुए प्रशंसक के साथ सुसज्जित का उपयोग करें.
4. (1-2 घंटे) समय की एक विस्तारित अवधि के ऊपर एक आर्द्र वातावरण में, ऊतक की सतह पर पानी या बर्फ के संक्षेपण के लिए निरीक्षण किया. ऊतक पर पानी संक्षेपण detrimentally LAESI प्रयोगों में इमेजिंग प्रदर्शन को ^{प्रभावित} करता है 1.
5. यदि आवश्यक हो, एक कमरे dehumidifier का उपयोग करें या एक पर्यावरण एक आभ्यांतरिक गैस (उदाहरण के लिए, सूखी नाइट्रोजन गैस) के साथ भर के लिए संक्षेपण को रोकने के चैम्बर में ठंडा नमूना ^जगह 1 .

2. LAESI आयन स्रोत के अनुकूलन

LAESI आयन स्रोत मध्य अवरक्त लेजर, प्रकाश स्टीयरिंग के लिए ऑप्टिकल तत्वों की एक श्रृंखला है और ध्यान केंद्रित के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अतिरिक्त नमूना धारकों, घटकों ठंडा, अनुवाद चरणों और एक विलायक वितरण प्रणाली के होते हैं. चित्रा 1 वायुमंडलीय दबाव एक मास स्पेक्ट्रोमीटर के आयन स्रोत के प्रवेश द्वार के लिए सम्मान के साथ इन तत्वों की विशिष्ट व्यवस्था को दर्शाता है.

1. के रूप में चित्रा 1, मास स्पेक्ट्रोमीटर नमूने शंकु _(घ-FP) के छिद्र के नीचे नमूना 15-20 मिमी की स्थिति में सचित्र.
2. 2.94 सुक्ष्ममापी तरंगदैर्ध्य और 10 हर्ट्ज पुनरावृत्ति दर पर एक मध्य IR लेजर प्रचालन. लेजर ~ 100 / μJ पल्स ऊर्जा उत्पादन attenuate.
3. सामान्य घटनाओं में लेजर नमूना में पल्स ऊर्जा (नमूना की सतह के संबंध के साथ सही घटनाओं कोण को देखने के जोड़े को सोने के दर्पण और एक ध्यान केंद्रित लेंस लेजर तरंग दैर्ध्य (उदाहरण के लिए, _एक Plano-उत्तल 2 CAF या ZnSe लेंस) पर पारदर्शी का एक संयोजन का उपयोग करें चित्र 1 में).
4. मास स्पेक्ट्रोमीटर नमूने शंकु के छिद्र के सामने स्थिति के मध्य अवरक्त बीम अक्ष 5-8 मिमी.
5. ध्यान केंद्रित लेंस स्थिति और लेजर बीम की नब्ज ऊर्जा को फोकल स्थान में ऊतक हटाने को प्राप्त करने के समायोजित करें. ablated मात्रा के आयाम इमेजिंग आवेदन के लिए (या तीन आयामी इमेजिंग में voxel) पिक्सेल के आकार का निर्धारण करते हैं.
6. मास स्पेक्ट्रोमीटर के इनलेट अक्ष के साथ लाइन में और एक छिद्र करने के लिए emitter ~ 10 मिमी (चित्रा 1 देखें) की नोक की दूरी पर nanospray emitter स्थिति.
7. Electrospray के लिए, 0.1% एसिटिक एसिड या अमोनियम एसीटेट additive सकारात्मक या नकारात्मक आयन मोड के लिए 0.1% के साथ क्रमशः 50% मेथनॉल समाधान तैयार है,. नमूने पर निर्भर करता है, acetonitrile, isopropanol, आदि जैसे अन्य कार्बनिक सॉल्वैंट्स, विश्लेषणात्मक कार्य के लिए उपयुक्त सांद्रता में मेथनॉल की जगह हो सकता है. electrospray की स्थिरता सफल इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है. विलायक चयन पर निर्भर करता है, प्रवाह दर और वोल्टेज छिड़काव करने के लिए स्थिर स्प्रे प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा जरूरत है.
8. प्रतिक्रियाशील LAESI ⁶ के लिए इमेजिंग अनुप्रयोगों में, electrosprayed समाधान reactants शामिल कर सकते हैं .
9. Electrospray emitter के माध्यम से ~ 300 nl / मिनट की एक प्रवाह दर पर electrospray समाधान देने के लिए एक सिरिंज पंप का प्रयोग करें.
10. यदि मास स्पेक्ट्रोमीटर छिद्र एक कम वोल्टेज (<500 वी जमीन के खिलाफ मापा) पर रखा है, उच्च वोल्टेज electrospray emitter (जैसे, 3000 वी) के लिए सीधे आवेदन के द्वारा या एक धातु यूनियन के माध्यम से electrospray उत्पन्न करते हैं. अन्यथा, सीधे electrospray या धातु संघ के माध्यम से emitter electrospray स्थापित करने के लिए जमीन.
11. शंकु के विमान में electrospray स्रोत LAESI द्वारा सबसे कुशल आयन पीढ़ी के लिए मोड छिड़काव प्रचालन. छिड़काव जन स्पेक्ट्रा पर उनके प्रभाव मोड पर ऑपरेटिंग चर के प्रभाव के लिए, चर्चा कहीं देख ^5,7,8.
12. ध्यान LAESI सेटअप के रिश्तेदार दूरी समायोजित LAESI आयन उपज के लिए अनुकूलन है, जबकि एक ही विमान में लेजर बीम emitter और छिद्र अक्षों रखने. कृपया विस्तृत निर्देश कहीं और मिल ^5.
13. एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ, नमूना पर पृथक गड्ढा के पार्श्व आयाम निर्धारित करते हैं.
14. तीन आयामी LAESI इमेजिंग प्रयोगों के लिए, व्यक्तिगत दालों के साथ पृथक प्रदर्शन और एक का उपयोग कर voxel की गहराई उदाहरण के लिए, निर्धारित करने के लिए, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी में ^z ढेर मोड 3.

3. आण्विक इमेजिंग और डेटा विश्लेषण

इमेजिंग प्रयोग में, ऊतक का नमूना कदम से बड़ा या पृथक स्थान के आयामों के बराबर आकार के साथ एक्स और वाई दिशाओं में लेजर के फोकल हवाई जहाज़ में ले जाया जाता है. स्थानिक संकल्प घटना लेजर बीम ध्यान केंद्रित द्वारा सीमित है.

1. नमूना की सतह पर ब्याज के क्षेत्र का चयन करें और (एक्स, वाई) इसी सीमाओं के निर्देशांक प्राप्त है.
2. एक gridding एल्गोरिथम (उदाहरण के लिए, अनुकूली ग्रिड, चयनित क्षेत्र इमेजिंग, आयताकार ग्रिड, सर्पिल पैटर्न, जेड स्कैनिंग, आदि) के साथ जो चयनित प्रत्येक पिक्सेल पर imaged किया जा क्षेत्र से अधिक समय ध्यान केन्द्रित के साथ नमूना की सतह रेखापुंज करने के लिए चुना.
3. तीन अक्ष अनुवाद चरण और सॉफ्टवेयर है कि पूर्व निर्धारित ग्रिड के अनुसार नमूना rastering करने में सक्षम है का उपयोग करें.
4. कुल इमेजिंग के लिए आवश्यक समय की गणना.
5. मास स्पेक्ट्रोमीटर के डाटा अधिग्रहण समय सीमा को अक्षम करें. यदि यह संभव नहीं है, डाटा अधिग्रहण इमेजिंग समय मूल्य की गणना करने के लिए समय सीमा सेट.
6. एक पुनरावृत्ति उचित दर पर मध्य अवरक्त लेजर स्रोत प्रारंभ जन स्पेक्ट्रम में प्रत्येक पिक्सेल पर ध्यान केन्द्रित करना समय के भीतर एक LAESI पार्श्व इमेजिंग प्रयोग करने के लिए पर्याप्त संकेत से शोर अनुपात का उत्पादन करने के लिए. 3 डी आणविक इमेजिंग के लिए, एक स्पेक्ट्रम अधिग्रहण लेजर स्रोत पुनरावृत्ति करने के लिए सफलतापूर्वक एक एकल लेजर पल्स भीतर उत्पन्न आयनों जन विश्लेषण दर की तुलना में उच्च दर का उपयोग करें. स्टार्ट संकेत के लिए रुको पृथक अनुक्रम आरंभ.
7. Electrospray स्रोत पर मुड़ें. सुनिश्चित करें कि वहाँ पूर्ण इमेजिंग के लिए आवश्यक समय के लिए पर्याप्त समाधान है.
8. इसके साथ ही स्टार्ट जन स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण, मध्य IR लेजर पृथक, और सतह स्कैनिंग.
9. जब इमेजिंग रन समाप्त हो गया है, सतह स्कैनिंग, मध्य आईआर lasing, और डाटा अधिग्रहण बंद करो.
10. लेजर स्रोत अक्षम करें.
11. उच्च वोल्टेज बंद करें.
12. सिरिंज पंप बंद स्विच.
13. Standby मोड के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर सेट.
14. Peltier - ठंडा इलेक्ट्रॉनिक्स बंद करें.
15. अक्रिय गैस प्रवाह बंद अगर प्रयोग किया जाता है.
16. एक सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए इसी स्पेक्ट्रा के साथ 3D विश्लेषण में पार्श्व इमेजिंग या voxels में पिक्सल के एक निरपेक्ष निर्देशांक सहसंबंधी.
17. पार्श्व और 3 डी आणविक छवियों को प्राप्त करने के विश्लेषण के निरपेक्ष निर्देशांक के खिलाफ चयनित मी / z मान के लिए आयन तीव्रता संकेत प्लॉट.

4. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 2 कुछ प्रमुख ऊतक प्रकार और इमेजिंग रूपात्मकता के लिए प्रतिनिधि परिणाम देता है. पैनल एक एक जानवर ऊतक खंड है कि प्रयोग के लिए निर्जलीकरण को रोकने के दौरान जमे हुए किया गया है के लिए ^एक मामले में दर्शाया गया है 1 इसके अलावा, नमूना एक सूखी नाइट्रोजन गैस वातावरण में स्थित किया गया था करने के लिए नमूना की सतह पर संघनक से पानी वाष्पकणों परिवेश से बचने के लिए.. एक 100-सुक्ष्ममापी मोटी एक चूहे के मस्तिष्क के राज्याभिषेक अनुभाग (Rattus norvegicus) laterally LAESI साथ imaged किया गया था. मस्तिष्क की संरचनात्मक क्षेत्रों (पैनल में ऑप्टिकल छवि देख) आणविक plasmalogens पीसी के लिए प्राप्त छवि (का.-33: 3) के साथ अच्छे संबंध दिखाने के लिए और / या पीई (का.-36: 3) मी / z 728.559 के साथ .

पैनल बी एक ज़ेबरा (Aphelandra squarrosa) संयंत्र पत्ता ऊतक के 3 डी LAESI इमेजिंग से पता चलता है. क्योंकि पत्तियों को निर्जलीकरण के खिलाफ एक प्राकृतिक सुरक्षा तंत्र के अधिकारी, नमूना परिवेश के वातावरण में पूछताछ ^{किया जा} सकता है 3. प्राप्त 3D आणविक छवियों प्राथमिक और माध्यमिक चयापचयों के लिए वितरण पैटर्न के एक किस्म का पता चला. दूसरों के अलावा, acacetin मी / z 285.076 के साथ दूसरों में एक सजातीय वितरण के साथ ऊपर से दूसरे और तीसरे परतों के पीले क्षेत्रों में उच्च आयन मायने रखता है पर खोजा गया था . इस वितरण में ऑप्टिकल छवि में देखा विचित्र रंगना के पैटर्न के साथ सहमति व्यक्त की.

चित्रा 1. LAESI प्रणाली के योजनाबद्ध (ते, electrospray emitter टिप, या, मास स्पेक्ट्रोमीटर नमूना शंकु के छिद्र, FL, लेंस ध्यान केंद्रित, एफपी, केन्द्र बिन्दु, पी, Peltier ठंडा चरण, एच एस, गर्मी सिंक). बात कण का एक भाग मध्य आईआर (लाल डॉट्स) के लिए चार्ज अणुओं और नमूने के आयनों (हरी डॉट्स) के साथ वरीयता प्राप्त बूंदों उपज electrospray के साथ पृथक coalesces के दौरान निष्कासित कर दिया. इन बूंदों से जारी आयनों का विश्लेषण और मास स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा दर्ज कर रहे हैं.

चित्रा 2. पार्श्व और 3 डी imagi के लिए प्रतिनिधि परिणामLAESI मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ एनजी (ए) शीर्ष पैनल एक चूहे (Rattus norvegicus) मस्तिष्क राज्याभिषेक अनुभाग और आणविक plasmalogens पीसी के लिए प्राप्त छवि (का.-33: 3) ऑप्टिकल छवि को दर्शाया गया है और / या पीई (का.-36 :) 3 मी / z 728.559. सफेद पैमाने बार 1 मिमी से मेल खाती है है. (संदर्भ ¹⁾ से अनुमति के साथ अनुकूलित . कॉपीराइट 2010 अमेरिकन केमिकल सोसायटी. (बी) वह नीचे के पैनल एक विचित्र ज़ेबरा संयंत्र (Aphelandra squarrosa) से एक पत्ती के 3 डी इमेजिंग से पता चलता है. मी / z 285.076 के साथ Acacetin दूसरों में एक सजातीय वितरण के साथ ऊपर से दूसरे और तीसरे परतों के पीले क्षेत्रों में उच्च आयन मायने रखता है पर खोजा गया था . ⁽³ संदर्भ) से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित. कॉपीराइट 2009 अमेरिकन केमिकल सोसायटी.

विभिन्न प्रकार के ऊतकों पानी सामग्री और तन्य शक्ति है, जो, बारी में, नमूनों की पृथक विशेषताओं को प्रभावित ^कर सकते हैं. नौ अलग करने के लिए इन प्रभावों को कम करने के प्रदर्शन, यह वांछित है कि लेजर प्रभाव, नमूना हैंडलिंग और विश्लेषण प्रोटोकॉल जब बीच बदलते संशोधित किया प्रमुख प्रकार के ऊतकों.

एकल कक्ष या उच्च संकल्प जांच के लिए, मध्य अवरक्त प्रकाश तीव्रता के बजाय एक ध्यान केंद्रित लेंस ऑप्टिकल फाइबर में युग्मित किया जा सकता ^है. 10 ऊतकों में चयनित कक्षों के करीब निकटता के भीतर फाइबर टिप स्थिति से, LAESI विश्लेषण पर प्रदर्शन किया जा सकता है एक एकल कोशिका स्तर.

एक लेबल मुक्त परिवेश ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए आयन स्रोत ^के रूप में, 11 LAESI ऊतकों में जैव रासायनिक प्रक्रियाओं की जांच के लिए महान क्षमता दिखाया गया है. प्रत्यक्ष विश्लेषण, पार्श्व और 3 डी इमेजिंग के अतिरिक्त लाभ के साथ, LAESI रूपरेखा के रूप में के रूप में अच्छी तरह इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए एक उभरती हुई bioanalytical उपकरण है.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

लेखकों अमेरिका अनुदान नंबर 0719232 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान (DEFG02 01ER15129) अमेरिकी ऊर्जा विभाग द्वारा, फाउंडेशन द्वारा इस काम के वित्तीय समर्थन के लिए आभारी हैं, और Protea Biosciences इंक, (Morgantown, WV) द्वारा. लेखकों को भी उसकी मदद करने के लिए प्रोटोकॉल के वीडियोटैपिंग दौरान जेसिका ए Stolee धन्यवाद देना चाहूंगा.

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2. Nemes, P. & Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Anal Chem 79, 8098-8106 (2007).
3. Nemes, P., Barton, A. A. & Vertes, A. Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem 81, 6668-6675 (2009).
4. Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y. & Vertes, A. Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem 80, 4575-4582 (2008).
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7. Nemes, P., Marginean, I. & Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal Chem 79, 3105-3116 (2007).
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9. Vertes, A. et al. Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry. Appl Phys A-Mater Sci Process 93, 885-891 (2008).
10. Shrestha, B. & Vertes, A. In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem 81, 8265-8271 (2009).
11. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z. & Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science 311, 1566-1570 (2006).

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