Atmosfäriskt tryck Molecular Imaging av biologisk vävnad och Biofilmer av LAESI masspektrometri

Nemes, P., Vertes, A. Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (43), e2097, doi:10.3791/2097 (2010).

Omgivande jonisering metoder i masspektrometri möjliggör analytiska undersökningar som ska utföras direkt på vävnad eller biofilm i native-liknande experiment. Laser ablation elektrospray jonisation (LAESI) är en sådan utveckling och är särskilt väl lämpad för utredning av vatten-innehållande prover. LAESI använder en mid-infraröd laserstråle (2,94 ìm våglängd) för att excitera vattenmolekylerna av provet. När ablation fluensen överskrids, är provmaterialet utvisades i form av partiklar och dessa projektiler resa till tiotals millimeter över provets yta. I LAESI är detta ablation plym stoppad av laddade droppar för att fånga en bråkdel av den utkastade provmaterial och omvandla dess kemiska beståndsdelar i gasfas joner. En masspektrometer försedd med ett atmosfäriskt tryck jonkälla gränssnitt är anställd för att analysera och registrera sammansättning frigörs joner som härrör från sonderade området (pixel) av provet. En systematisk förhör över en rad pixlar öppnar en väg för molekylär bildanalys i mikrosondanalys läget. En unik aspekt av LAESI masspektrometriska bildbehandling är djup profilering som i kombination med laterala imaging, möjliggör tredimensionella (3D) molekylär bildanalys. Med dagens sidled och djup resolutioner av ~ 100 ìm och ~ 40 ìm, respektive hjälper LAESI masspektrometrisk bildbehandling för att utforska den molekylära strukturen av biologiska vävnader. Häri går vi igenom de viktigaste delarna av en LAESI system och ge riktlinjer för en lyckad avbildning experiment.

Följande protokoll beskrivs de viktigaste stegen i laser ablation elektrospray jonisation (LAESI) experiment och ger representativa exempel för laterala och tredimensionella (3D) imaging för djur och växter vävnadsprov. Ytterligare experimentella och tekniska detaljer kan erhållas från annat håll. ^1-6

1. Tissue Förberedelse och montering

1. Om sektionering behövs, använd en cryomicrotome avsnitt vävnaden till 10-100 ìm tjocka skivor vid -10 till -20 ° C, om inte annat rekommenderas för en speciell vävnadstyp.
2. Montera delarna på en plan yta (t.ex. kemiskt förrengöras glasskiva) direkt utan kemiska modifierare. För sektioneras vävnader, tina-montera sektionerna och säkra provhållaren till ett Peltier-kylning steg omedelbart efter tö-montering för att hålla vävnaden fryst under hela analysen. Detta steg behövs för att minimera / förhindra molekylära migration i avsnittet.
3. Om det behövs använder en kylfläns utrustad med en strömsnål fläkt för att underlätta värmeavledning från Peltier-scenen för att hålla vävnaden frysas.
4. I en fuktig miljö under en längre tid (1-2 timmar), inspektera för kondensering av vatten eller is på vävnaden ytan. Kondens på vävnaden påverkar negativ för bildhantering prestanda i LAESI experiment. ¹
5. Om det behövs använder ett rum avfuktare eller placera kyls provet i en klimatkammare fylld med en inert gas (t.ex. kvävgas) för att förhindra kondens. ¹

2. Optimering av LAESI jonkälla

Den LAESI jonkälla består av en mid-infraröd laser, en serie optiska element för lätta styrning och fokusering samt ytterligare innehavare prov, kyla komponenter, stadier översättning, och ett lösningsmedel leveranssystem. Figur 1 visar den typiska placeringen av dessa delar med hänsyn till ingången av det atmosfäriska tryck jonkälla av en masspektrometer.

1. Som visas i figur 1, position provet 15-20 mm under öppningen av masspektrometer provtagning konan (D _eller-FP).
2. Kör en mid-IR-laser på 2,94 ìm våglängd och 10 Hz repetitionsfrekvens. Dämpa laseruteffekten till ~ 100 μJ / pulsenergi.
3. Använd en kombination av guld speglar och en lins transparent på lasern våglängd (t.ex. en PLANKONVEX CaF ₂ eller ZnSe objektiv) att koppla energi laserpuls in i urvalet vid vinkelrätt infall (se höger infallsvinkeln med avseende på provytan i figur 1).
4. Placera i mitten av infraröda strålen axel 5-8 mm framför mynningen av masspektrometer provtagning kon.
5. Justera fokus linsens position och pulsen energin i laserstrålen för att uppnå vävnad i fokus plats. Måtten på borttagen volym bestämma pixel (eller Voxel i tredimensionell avbildning) storlek för bildprogram.
6. Placera en nanospray emitter i linje med inloppet axel masspektrometer och en öppning till emitter spets avstånd på ~ 10 mm (se figur 1).
7. För elektrospray, förbereda 50% metanol lösning med 0,1% ättiksyra eller 0,1% ammoniumacetat tillsats för positiv eller negativ jon-läge, respektive. Beroende på provet, andra organiska lösningsmedel, såsom acetonitril, isopropanol, etc. kan ersätta metanol vid koncentrationer lämpliga för den analytiska uppgiften. Stabiliteten i elektrospray är avgörande för framgångsrik avbildning. Beroende på lösningsmedel urval, flödet och de sprutar spänning behöver justeras för att uppnå en stabil spray.
8. För reaktiva LAESI ⁶ i bildprogram, kan electrosprayed lösningen innehåller reaktanter.
9. Använd en sprutpump för att leverera elektrospray lösningen genom elektrospray sändaren med en flödeshastighet på ~ 300 Nl / min.
10. Om masspektrometer öppningen hålls på en låg spänning (<500 V mätt mot jord), generera elektrospray genom att tillämpa hög spänning direkt till elektrospray emitter (t.ex. 3000 V) eller genom ett metallförband. Annars marken direkt elektrospray sändaren eller genom metall unionen att etablera elektrospray.
11. Använd elektrospray källa i kon-jet sprutning läget för de flesta effektiva jon generationen av LAESI. För effekten av driftvariabler på besprutning lägen och deras inverkan på massan spektra, se diskussionen någon annanstans. ^5,7,8
12. Försiktigt justera den relativa avstånden i LAESI setup för att optimera för LAESI jon avkastning samtidigt som laserstrålen, sändaren och axlarna öppning i samma plan. Här hittar du detaljerade anvisningar på annat håll. ⁵
13. Med en optisk mikroskop, bestämmer laterala mått ablation krater på provet.
14. För tredimensionella LAESI avbildning experiment, utföra ablation med individuella pulser och hur djup en Voxel använda, till exempel z-stack mode i optisk mikroskopi. ³

3. Molecular Imaging och dataanalys

I avbildning experimentet är vävnadsprov flyttade i fokalplan lasern i X-och Y-led med steg storlekar större än eller lika med mått ablation plats. Den rumsliga upplösningen begränsas av fokusering av laserstrålen riktas.

1. Välj område av intresse på provets yta och erhålla (X, Y) koordinaterna för motsvarande gränser.
2. Välj ett gridding algoritm (t.ex. adaptiv rutnät, valda regionen bildbehandling, rutnät, spiralmönster, Z scanning, etc) med vilka raster provets yta med utvalda Väntetid varje pixel över området som ska avbildas.
3. Använd en treaxlig översättning scenen och programvara som klarar av rastrering provet enligt förutbestämda nätet.
4. Beräkna den totala tid som krävs för avbildning.
5. Inaktivera uppgifter gränsen förvärvet tiden av masspektrometer. Om detta inte är möjligt, ställ in uppgifter gränsen förvärvet tid till det beräknade avbildning tidsvärde.
6. Starta mitten av infraröd laser källa vid en repetitionsfrekvens korrekt att producera tillräckligt med signal-brus-förhållandet i massan spektrum inom uppehållstiden vid varje pixel för att utföra en LAESI lateral avbildning experiment. För 3D molecular imaging, använd en kurs spektrum förvärv högre än laserkälla repetitionsfrekvens att framgångsrikt massa-analysera joner genereras i en enda laserpuls. Vänta på START-signal att inleda ablation sekvensen.
7. Slå på elektrospray källan. Se till att det finns tillräckligt med lösning för hela tiden som krävs för avbildning.
8. Samtidigt START förvärvet av massa spektra mitten av IR-laser ablation, och ytan skanning.
9. När avbildning körs är klar STOP ytan skanning, mitten av IR-lasern, och datainsamling.
10. Inaktivera laserkälla.
11. Stäng av hög spänning.
12. Stäng av sprutpump.
13. Ställ masspektrometer till viloläge.
14. Stäng av Peltier-kyla elektronik.
15. Stäng inert gas flöde om sådan används.
16. Använd en programvara för att korrelera absoluta koordinater pixlar i sidled avbildning eller voxlar i 3D analys med motsvarande spektra.
17. Plotta signalen jon intensiteten för en vald m / z värde mot den absoluta koordinater för analys för att få sidled och 3D molekylära bilder.

4. Representativa resultat

Figur 2 ger representativa resultat för vissa viktiga vävnadstyper och villkor avbildning. Panel A visar ett fall för en animalisk vävnad avsnitt som har varit fryst under försöket att förhindra uttorkning. ¹ Dessutom var provet i en torr kvävgas miljö för att undvika omgivande vatten ångor kondenseras på provets yta. En 100-ìm tjocka koronalt del av en råtta hjärna (Rattus norvegicus) var sidled avbildade med LAESI. Den anatomiska regioner i hjärnan (se optisk bild i panel A) visar god korrelation med de molekylära bilden erhålls för plasmalogens PC (O-33: 3) och / eller PE (O-36: 3) med m / z 728,559.

Panel B visar 3D LAESI avbildning av en Zebra anläggning (Aphelandra squarrosa) bladvävnad. Eftersom bladen har en naturlig försvarsmekanism mot uttorkning, kan provet förhördes i den omgivande miljön. Erhålls 3D molekylära bilder visade en rad olika utbredningsmönster för primära och sekundära metaboliter ^3. Bland annat var acacetin med m / z 285,076 upptäcks vid högre jon räknas i den gula sektorer av den andra och tredje lager från toppen med en homogen fördelning i de övriga. Denna fördelning avtalas med mönster av färgskiftning ses i den optiska bilden.

Figur 1. Schematisk av LAESI systemet (ES, elektrospray emitter spets, eller öppning av masspektrometer provtagning kon, FL, med fokus lins, FP, brännpunkt, P, Peltier kylning stadium, HS, kylfläns). En del av partiklar utvisad under mitten av IR-ablation (röda prickar) sammanbinds med elektrospray att ge laddade droppar ympats med molekyler och joner i provet (gröna prickar). Jonerna frigörs från dessa droppar analyseras och registreras av masspektrometer.

Figur 2. Representativa resultat för lateral och 3D fantasi. ng med LAESI masspektrometri (A) Den övre panelen visar den optiska bilden av en råtta hjärna (Rattus norvegicus) koronala avsnitt och den molekylära bilden erhålls för plasmalogens PC (O-33: 3) och / eller PE (O-36 : 3) med m / z 728,559. Den vita Skalningsfält motsvarar 1 mm. Anpassad med tillstånd från (referens ^1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Den nedre panelen visar 3D-avbildning av ett blad från en brokig Zebra anläggning (Aphelandra squarrosa). Acacetin med m / z 285,076 upptäcktes vid högre jon räknas i den gula sektorer av den andra och tredje lager från toppen med en homogen fördelning i de övriga. Återges med tillstånd från (referens ^3). Copyright 2009 American Chemical Society.

Olika vävnadstyper uppvisar varierande vattenhalt och draghållfasthet, som i sin tur kan påverka ablation egenskaper proverna. ⁹ För att minska dessa effekter är det önskas att lasern fluensen, provhantering och analys protokoll revideras vid byte mellan stora vävnadstyper.

För enstaka cell eller högre undersökningar upplösning, kan mitten av infrarött ljus kopplas till en skärpt optisk fiber i stället för en lins. ¹⁰ Genom att placera fiberspetsen i närheten av de markerade cellerna i en vävnad kan LAESI analys utföras på en encelliga nivå.

Som en etikett utan jonkälla för omgivande jonisering masspektrometri har ¹¹ LAESI visat stor potential för utredning av biokemiska processer i vävnader. Med den extra fördelar av direkt analys, lateral och 3D-avbildning, är LAESI en framväxande bioanalytiska verktyg för profilering som tillämpningar avbildning.

Inga intressekonflikter deklareras.

Författarna är tacksamma för finansiellt stöd till detta arbete av den amerikanska National Science Foundation i Grant nr 0719232, av US Department of Energy (DEFG02-01ER15129), och av Protea Biosciences, Inc. (Morgantown, WV). Författarna vill också tacka Jessica A. Stolee för hennes hjälp under videofilmning av protokollet.

1. Nemes, P., Woods, A. S. & Vertes, A. Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem 82, 982-988 (2010).
2. Nemes, P. & Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Anal Chem 79, 8098-8106 (2007).
3. Nemes, P., Barton, A. A. & Vertes, A. Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem 81, 6668-6675 (2009).
4. Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y. & Vertes, A. Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem 80, 4575-4582 (2008).
5. Nemes, P. & Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging, in Methods in Molecular Biology, Vol. 656, (eds) S. S. Rubakhin & J. V. Sweedler, Springer in press (2010).
6. Shrestha, B. et al. Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry. Analyst 135, 751-758 (2010).
7. Nemes, P., Marginean, I. & Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal Chem 79, 3105-3116 (2007).
8. Nemes, P., Goyal, S. & Vertes, A. Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization. Anal Chem 80, 387-395 (2008).
9. Vertes, A. et al. Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry. Appl Phys A-Mater Sci Process 93, 885-891 (2008).
10. Shrestha, B. & Vertes, A. In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem 81, 8265-8271 (2009).
11. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z. & Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science 311, 1566-1570 (2006).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.