В естественных условиях микро-циркуляции Измерение в скелетной мышце путем Intra-жизненно микроскопии

Мембраны эритроцитов окрашивание

1. Мышь клетки красной крови были исправлены с тем же штаммом мыши с гепаринизация.
2. Мышь РБК окрашивали PKH26 красителя (551/567 нм, красный флуоресцентный комплект компоновщика клетки, Sigma, США).
3. РБК промывали в PBS и инкубировали с 2 мкм решение PKH26 красителя в течение 5 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением плазмы (тепло инактивированной в течение 1 часа при температуре 65 ° C заранее) и инкубировали в течение 1 минуты.
4. Окрашенных РБК промывали 5 раз с PBS.

Мышь Подготовка

1. От трех до шести месяцев летний мужчина C57BL/10 мышей были использованы в этом исследовании. Мы наркозом мышей при введении препарата в фенобарбиталом (50mg/kgBW).
2. Мыши были тогда интубированных с 20-Gage полиэтиленовых труб, искусственной вентиляции легких, и нагревают при температуре 37 ° С на обогреватель Kapton лист связан с термопары датчика и обратной связи регулятора температуры системы.
3. Вентральной стороне шеи был выбрит. Правой и левой грудино-сосцевидный мышцы подвергались. Мышцы были поддержаны из нержавеющей стали и держатель superfused стерильным раствором Кребса Рингера.

Инъекция

1. Витражи были эритроциты нагревают при 37 ° С, разбавляют Кребса Рингера. 50ul окрашенных эритроцитов (гематокрит 12%) вводили мыши из полового члена вены.

В естественных условиях Микроскопические наблюдения скелетных мышц

Мы следовали Джефф В. Лихтман 'ы метода с модификацией ^1:

1. Животные были помещены на грелку на вершине ручной железо этапе Nikon Eclipse-800 микроскоп. Водо-погружения объективы были использованы для живых эпи-флуоресцентного наблюдения. Мы наблюдали PKH26 окрашенных РБК течет внутри сосудистого под флуоресцентным светом ртутной лампы. Мы определили первичные артериол, среднее артериол, капилляров и вен их эритроциты направления потока и архитектур.
2. Активизировались SIT камера (Hamamatsu Photonics, C2400, Япония) и видео-захвата кадров были установлены, чтобы захватить низкой интенсивности сигнала на видео в реальном времени скорости (30 кадров в секунду). Изображения были записаны на DVD, видео файлов.

Миостимуляторы

1. Электрический импульс, создан с помощью стимулятора периферических нервов (Innervator 252, Fisher & Paykel здравоохранения, Новая Зеландия), и доставлен в мышцах поверхность через покрытием из нержавеющей зонда. Минус конец зонда был сделан на проксимальной части мышцы и плюс конце был сделан на дистальной части мышцы. Столбняк стимуляции были даны из расчета 50 Гц в течение 5 секунд. Электрические стимулы не вызывают прямого ущерба myofiber по близости от площади контакта.

РБК потока анализ

1. Записанные изображения DVD видео были перенесены видео файлы Savant образ с помощью программного обеспечения видеозахвата (Video Savant, США). Видеоизображение, были рассмотрены в установленном скорость, чтобы визуализировать отдельных окрашенных РБК. РБК потока измерялась путем подсчета РБК, который летел через сосредоточены первичные артериол в минуту.

Важно techinical точек таковы: (1) поддержание физиологического состояния животного (вентиляция, рН perfusative решение, температуры тела), (2) объемом впрыска от окрашенных РБК, и (3) условия наблюдения (оптимальный объектив Выбор, интенсивности флуоресценции). Потенциальные будущие приложения являются: (а) вместе с pharmacophysiological и / или молекулярно-биологических мероприятий, (б) долгосрочные наблюдения артерио / arteriolo-склероз и образование новых сосудов.