子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

子宮内エレクトロポレーションのための基本的なプロトコルはKriegsteinラボ^1、2から別のJoveの記事で詳細に記載されている。この手法はもともと大隅研究室³に記載され、我々のプロトコルがLoTurcoラボ⁴で開発されたものに基づいています。我々は、神経突起伸長における遺伝子機能の研究に子宮内エレクトロポレーションに適用される我々のプロトコルの説明に続いて最も重要な細部、を中心に、ラット胚の子宮内エレクトロポレーションのために我々のプロトコルの概要について説明します。

（1） 子宮内エレクトロポレーションで

1. DNAとローディング針の準備
   子宮内エレクトロポレーションのための最初のステップは、DNAを使用すると、注入するコンストラクトを決定するために実験を設計することです。このメソッドは、misexpressingまたは関心のある遺伝子をノックダウンの両方に便利です。あなたがmisexpressingまたは過剰発現する遺伝子を予定している場合は、神経前駆細胞で活性であるプロモーターを使用してください。我々はニワトリβ-アクチンプロモーターとCMVエンハンサー⁵から構成されてCAGGSプロモーターを、お勧めします。細胞の小さなサブセットのみが子宮内エレクトロポレーションに使用してトランスフェクトされているので、それはあなたが正常に電気穿孔したこれらの細胞に従うことができるようにコードするプラスミドGFPなどの蛍光タンパク質を指定することが重要です。をコードするプラスミドのGFPの場合、我々はマイクロリットルあたり0.5μgの濃度でDNAを調製することをお勧めします。 shRNAコンストラクトの場合は、我々は効率的でμL結果あたり0.5から1.0μG目的遺伝子のノックダウンすることを見出した。過剰発現またはmisexpressionの場合は、我々は遺伝子の大きさと実験のために呼び出すことの発現のレベルに応じて、マイクロリットル当たり1.0〜3.0μgを使用してください。 DNAはキアゲンエンドトキシンフリープレップキットを用いて調製し、1 × PBSで希釈されています。我々は、そう、動物のくずのために我々は注射のためのDNAの混合物の10μLを準備し、胚の脳あたり約0.5から1.0μLを注入する。我々は注入されたDNAをフォローできるように、我々は、DNAにファストグリーンの1μLを加える。
   正しい形状に針を引っ張ると、重要なステップです。その後、我々の^1,2を Walantus らは DNAを提供するための別のシステムを使用しているので、その針の準備もslighly異なります。あなたの針を引っ張るために使用する設定は、使用している針引き手のブランドに依存するであろう。我々はDavid K​​opfはからモデル750を使用してください。我々が使用する設定は以下の通りです：ヒート1：9.0、ヒート2：0、Soleniod：0、フィラメントの大きさ3.0ミリメートル、ヒーターの近接さ3mm、時間：10秒。一度プル、我々は、開口部の最大の部分から先端までの距離が11 mmであることなど〜45度の角度でかみそりの刃で私たちの針をカット。私たちは、その後、針のバックエンドからDNAをロードする。私たちは、その後、コーン油と針の残りのスペースを埋める。 DNA注入の場合、我々はPicospritzer IIIを使用してください。それぞれの針のためにカットされている正確なベベルに応じて、我々は、4.0から6.0にPicospritzerを設定します。我々は、針からDNAを排出加圧空気を供給するためにフットペダルを使用してください。
2. 手術のために動物を準備
   我々はこれらの手術のために独占的に病原体フリーSprague Dawleyラットを使用してください。他のいくつかのラボでは、同様に遺伝子型の異なるマウスを使用してください。ここでは、E15ラット胚のエレクトロポレーションのために我々のプロトコルを示して説明しますが、 子宮内エレクトロポレーションは、日常的にE13とE18の年齢の間にラットで行われます。初期段階のエレクトロポレーションは、大脳皮質の深い層をターゲットにしながら、後の段階のエレクトロポレーションはより多くの表面的な層をターゲットにしています。
   手術が始まる前に動物をブプレノルフィン（0.05〜0.1 mg / kg体重）の術前投与が与えられます。動物を麻酔するための複数のオプションがあります。我々が日常的にケタミン（40〜80 mg / kg体重）及びキシラジン（5〜10 mg / kg）を^1,2の腹腔内注射を使用している間Walantus らは 、isofuorane吸入を利用しています。つま先のピンチは、常に動物が完全に麻酔して応答しないことを保証するために実行する必要があります。動物は、外科的処置を通して加熱されたパッドの上に保持されます。
   動物の毛皮は、切開の地域で剃毛、およびヨウ素との三回に続いてエタノールで3回洗浄する。切開は、筋肉の切開続いて、正中線のちょうど外側の皮膚で作られています。子宮角を非常に慎重に公開されています。彼らは優しく指先を使用して、体腔外にからかわれている。彼らは、体腔外にある間、滅菌PBSで胚が水和してください。
3. 注入DNAとエレクトロポレーション
   最初にこれらの手術を行って起動すると、最も難しい部分は、側脳室を埋めるように、DNAを注入する必要がある場所に慣れてきているし、正しい地域をヒットするために、針を注入深に慣れて。あなたがidentをできるように、胚は優しく指先で操作されます頭がどこにあるかify、そしてあなたがよく見ると、正中線縫合糸を見ることができます。これは、側脳室が存在する場所を判断するために使用できる一般的なランドマークとして機能します。我々は、子宮壁を通って側脳室へのDNAを注入する。側脳室がDNA /染料混合物で満たされるまで、DNAの複数のパルスが実行される - 私たちは、DNAの注入を制御するためのフットペダルを使用してください。私たちは、その後、胚の頭部の両側にパドルの電極を配置し、胚の頭部全体にパルスを供給するために別のフットペダルを使用。電極の配置は、電気穿孔さ皮質のどの領域を決定する上で重要です。 DNAは負に帯電しているので、DNAは電荷がパドルを介して払拭され、正極に向かって移動する。電極の正確な配置に応じて、細胞の異なるサブセットがターゲットされます。我々は日常的に大脳全体の背内側の位置に近い正極を配置する。しかし、LoTurcoラボは美しくて、大脳のより腹側方の領域に電極を配置した場合に、皮質-線条体の境界と外側皮質流れ⁶のヒット細胞の細胞を標的とすることができることを示した。それぞれの胚は、エレクトロポレーションすることができ、DNAの構造の異なる組み合わせは、それぞれの胚で使用することができます。
4. 縫合と術後ケア
   すべての胚のエレクトロポレーションに続いて、子宮角を慎重に体腔に戻され、筋層と皮膚の両方を縫合されています。この技術はWalantus ら ^1,2で説明されています。彼らは麻酔から回復するまで、動物は連続的に監視され、そして鎮痛剤ブプレノルフィン（0.05〜0.1 mg / kgの）ごとに8〜12時間に投与される。

2。培養は、皮質ニューロンのエレクトロ

1. エレクトロポレーションの脳を収穫し、エレクトロポレーション領域を解剖
   子宮内エレクトロポレーションでは、次のin vivoでの解析のために、動物は成人期に出生後早期にエレクトロポレーション後24時間から、いつの時点で収穫することができる。しかし、培養するときの主ニューロン我々は、E16でのエレクトロポレーション後24時間を収穫。この時点では、エレクトロポレーション胚がGFPの検出可能なレベルを表現している。
   動物は二酸化炭素の吸入と迅速な断頭を使用して安楽死させる。胚は、胚がどのDNAプラスミドを電気穿孔されたを追跡すること、子宮外切開し、二価カチオンとのHBSSに配置されます。それは、フィルタ処理HBSS、滅菌チューブ、プレート、そして解剖用オートクレーブのツールを使用することが重要です。皮質は、外切開し、髄膜は、ボンネットに顕微鏡を使用して削除されます。これらの皮質は、GFPを視覚化する能力を持つ解剖顕微鏡下で観察されています。大脳皮質のGFP陽性領域には識別されず、我々UE皮質からGFP陽性領域をカットするヴァンナはさみされています。これらの作品は、15 mlコニカルチューブの二価カチオンなくHBSSに配置されます。
2. 神経細胞を解離し、めっき
   すべてのGFP陽性領域が解剖されると、HBSSは、0.25％トリプシンで置き換え、そして5分間37℃でインキュベートする。トリプシンは、削除メッキの培地（DMEM +5％FBS +ペン/連鎖球菌+グルタミン）、および細胞を解離するために摩砕し、5〜7倍に置き換えられます。使用されるボリュームは、組織の存在量に依存する。解離細胞はその後、CC2コーティングチャンバースライドに播種されています。メッキのメディアの1.5mlの体積の2つのチャンバースライド用、我々は、板室あたり200,000-350,000細胞を。 4時間後、メッキのメディアは、吸引し、チャンバーあたり1.5 mLのニューロン培養培地（Neurobasalメディア+ B27サプリメント+グルタミン+ゲンタマイシン）に置き換えられます。

3。神経突起の伸長を分析

1. 文化を固定し、免疫染色
   これらの細胞の遺伝子操作の短期effecsを測定するために、我々はin vitroで三日後に一次ニューロンを収穫。一次ニューロンは、追加分析のために長く培養する場合は、メディアの半分は3日ごとに交換する必要があります。文化を固定するため、我々は、チャンバーから培地を吸引除去し、15分間、4％paraformaldhydeでニューロンを修正。以下の固定は、細胞をPBSで2回洗浄し、次いでブロッキング溶液（2％ロバ血清0.1％トリトンPBSでX - 100）1時間。に置かれている次いで、細胞を1時間一次抗体でインキュベートする。ベータIIのチューブリンの免疫染色のラベルneruonal細胞体、樹状突起と軸索 - 神経突起伸長の分析については、我々は神経細胞を識別するために、抗βtubululinの抗体を使用してください。その後、細胞を5分間PBSで3回洗浄し、DAPIで核を対比してマウントさらに3つのPBSの洗浄、続いて、1時間のCy3 -抗マウスでインキュベートする。
2. NEの測定uriteの長さ
   GFP陽性、β- IIIチューブリン陽性ニューロンの画像は、MC100カメラシステムでツァイスのAxioskopに取得されます。いくつかの変数は、すべての神経突起の長さは、最長の神経突起の長さを含めてこれらのGFP陽性細胞で調べることができます、神経突起、細胞体の大きさ、等の分岐を我々は、ノックダウンや遺伝子の過剰発現により神経突起の伸長を分析するためにこのメソッドを使用している神経突起の長さを中心に、神経発達と神経変性に関連。神経突起の伸長を測定するために、我々はAxioVisionのLE 4.4ソフトウェアを（ツァイスから）使用してください。このソフトウェアの中で、"アウトライン"ツールを選択するオプションがあります。このツールを使用すると、それぞれの神経突起の長さを追跡するために、コンピュータのマウスを使用することができます。それはあなたの神経突起の正確な測定を得るために使用されていることを客観的に定義することが重要です。これらの分析を行うために、我々は通常、20倍対物レンズを使用してください。

4。代表的な結果

我々は、Sprague Dawley系産仔数は6と14の胚の間の範囲することを見出した。我々は通常、胚のすべてをエレクトロ。それぞれの胚は、DNAの異なる組み合わせでエレクトロことができます。しかし、我々は通常、これらの脳解離し、メッキの前に同じ条件とプールに少なくとも4つの頭脳をエレクトロ。

我々は、このテクニックでエレクトロポレーションの脳の約75％がそれは背内側や腹外側野（図1）であるかどうか、皮質の所望の領域をターゲットとしていることを発見した。さらに、我々はそのようなTbr1正の層のVIニューロン、後にエレクトロポレーションのターゲット間CTIP2正、TBR1負の層のV細胞、および、まだ後にエレクトロポレーションのターゲットBrn2正の層II / III細胞としてE13 - 14ターゲット深い層ニューロンで早期にエレクトロポレーションを発見した。別のマーカーとの皮質の神経細胞サブタイプの仕様の説明の優れた説明がMoleneauxら⁷による記事を見つけた。図2は15.5、17.5日胚のどちらかでエレクトロと生後5日目で収穫された脳の冠状断面を示しています。赤で示されてはOct6ために免疫染色される。あなたが標的としたものを細胞層の個体数を確認するために文化のマーカーを免疫染色することができます。我々はあなたが同じごみ（言い換えれば、ターゲットは他の技術的なバリエーションではなく、その後の胚タイムポイントに依存する）のすべての胚の細胞の同じ細胞層の人口をターゲットに期待できることを見出した。

文化では、GFP陽性の細胞のパーセントは、GFP陽性の領域（図3）を解剖しているときにどのように保守的に応じて多種多様であることができる。しかし、我々は非常に保守的であり、細胞の唯一のGFP陽性パッチを解剖する場合でも、我々が観察するという割合が最も高い5〜10％です - あなたは、エレクトロポレーションされた皮質の領域を解剖しているが、細胞だけつの層になります対象となる。この低いトランスフェクションeffciencyはプロセスが分析することelectoporatedセルに属しているかを特定するのに役立ちます。この高い密度でプレーティング細胞がheathier文化を持っていることに寄与する、しかし、GFP陰性細胞（図3）内のどの細胞体に属するプロセスがわかりにくいことです。

あなたがトラブルエレクトロポレーションした細胞の微細なプロセスのすべてが表示されない場合は、次のいずれかをあなたがGFPの発現を増加させるelectroporatingされているGFP DNAの濃度を増加させることができるか、Invitrogen社から抗GFP抗体を（使用して解離細胞を免疫染色することができます）Cy2と二次抗体と一緒に。

図1。E15.5のSprague - Dawleyラットを、プラスミドGFPでエレクトロと三日後に回収した。電極の配置に基づいて、皮質の異なる領域がターゲットされます。全体脳内AFショーGFP蛍光。

図2。E15.5（）またはE17.5（B）Sprague - Dawleyラットは、生後5日目にGFPプラスミドと収穫でエレクトロポレーションした。脳はcoronallyビブラトームを（100ミクロンの切片）を使用して、切片を固定し、Oct6（赤）のために免疫染色を行った。 AとBは、免疫染色切片の共焦点画像を示す。

図3。E15.5のSprague - Dawleyラットを、プラスミドGFPでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後24時間は、脳を採取し、GFP陽性、エレクトロポレーション領域は、ビデオで説明するように、解剖し、解離された。 in vitroでの3日後、細胞を固定し、免疫染色BIII -チューブリン（赤）およびDAPI（青）（A、C）で核を染色した。最も長い神経突起の長さはAxioVisionのソフトウェアを用いて測定した（B、D）。

プライマリーニューロン培養の in vitro研究では神経突起伸長の定量分析を可能にする。神経突起伸長、shRNAまたはmisexpression構造にどのように影響する遺伝的変化を研究するために化学物質のトランスフェクションまたはウイルスの伝達を介して一次ニューロンに導入することができる。しかし、一次皮質細胞と、細胞の種類（別の層からグルタミン酸作動性ニューロン、抑制性神経細胞、グリア細胞）の異種プールはこれらのメソッドを使用してトランスフェクトされる。胚性齧歯類の大脳皮質でのDNA構築物を導入するために子宮内エレクトロポレーションでの使用は、標的とする細胞の特定のサブセットを可能にする：初期胚大脳皮質のエレクトロポレーションは、大脳皮質の深い層をターゲットにしながら、後期胚の時点においてでエレクトロポレーションはより多くの表面的な層をターゲットにしています。さらに、皮質の背内側対腹側外側の領域のターゲット内の個々の胚の結果の頭部間の電極の差動配置。

特定の層のターゲット：

あなたが側脳室内にDNAを注入し、エレクトロときは、すぐに横venrtricleの内側を覆う細胞のみをターゲットとしている：これらの細胞は放射状グリア前駆新皮質の細胞だけでなく、ちょうど彼らのターミナルの有糸分裂を受けている細胞である。興味深いことに、エレクトロポレーションは、次の日に調べたときに、標的細胞はbirthdated細胞のパターンと一致している。言い換えれば、electropoartionの日に自分の端末の有糸分裂を受けるものを言っている生まれている細胞は、標的とされているセルです。放射状グリア細胞はまた、心室の表面に存在するため、人はこれらの細胞を標的とされること、およびこれらの細胞から子孫もすべて対象とされるという仮説を立てたかもしれません。しかし、そうでない場合、セルの後の世代には、GFPを発現しない。それは、放射状グリア細胞の分裂の複数のラウンドは、プラスミドアウト希釈する可能性があります。

アプリケーション：

このメソッドは、遺伝子の影響のshRNAしない構造体のエレクトロポレーションを経由してノックダウンだけでなく、cDNA構築物のmisexpressionでを調べるための優れた方法です。我々は、神経変性および精神疾患に関与する遺伝子の研究にこのtechniqeを適用している。この技術によって、我々は、野生型とこれらの疾患で重要な遺伝子の変異体の両方を紹介し、神経形態への影響を調べる。さらに、我々は、cDNAやshRNAのcontructを共同electroporatingによって内因性遺伝子産物の有無で突然変異または選択的スプライシング変異体の発現の効果を調べることができます。複数の遺伝子をノックダウンによって、他の遺伝子産物^8,9で一つの遺伝子産物のノックダウンの効果を救出しようとすることによって：共同electorporationも2つの遺伝子産物間の遺伝的相互作用を調べるために利用することができます。