Органотипической гиппокампа Модель культуры фрагмент за рассмотрение нейронов травмы

1. Подготовка

Прежде чем начать, собрать необходимые хирургические инструменты, рассечение и питательных сред, а также на 7 дней старая крыса или мышь щенков. Протокол является одинаковым для мышей и крыс препаратов.

(Я) Материалы и оборудование

• Операционная ножницы (прямая длина 6 ", кот # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
• Micro рассекает ножницы, (длина 4 '", кошка # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
• Углеродистая сталь Дюмон Пинцет (кошка # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
• Измененный стекло "передачи" пипетки (низ пипетки Пастера удалены и сглаженные края)
• Aclar пластиковой пленки сократить до 2 "в х 2" на площадях (Honeywell, # 812071, Потсвилл, PA)
• Обложка губки 4, по 3 в (Кендалл, кошка # 3157, Мэнсфилд, штат Массачусетс)
• 30 мм мембраны Millicell вставками (0,4 мкм, Millipore, Bedford, MA)
• Mcllwain тканей вертолет с обоюдоострым лезвием бритвы (McILwain ткани измельчитель, Vibratome компании, Сент-Луис, Миссури)
• Инвертированный микроскоп с ПЗС-камера и программное обеспечение для анализа изображений

(II) Препарирование Средний (DM, 1 л при рН 7,3)

(III) Культура средой (400 мл)

(IV) Животные

На 7 дней старая крыса или мышь послеродовой щенков, как правило, один помет в эксперименте.

2. В День культуры

1. Все рассечение инструментов и Aclar пленка должна быть промыты в 70% этаноле в течение 30 минут до начала. Поверхности вскрытия капота, лезвия, и ткани вертолета должны быть продезинфицированы с этанолом.
2. Подготовка нескольких (3-4) 6 луночных культуры ткани, добавить 1 мл культуральной среды на лунку, и вставьте Millipore мембрана в каждую лунку. Место 6-луночных планшетах в 37 ° инкубаторе до готовности передать ломтиками.
3. Подготовка нескольких (4-6) 60 мм пластин с СД и место на льду.
4. Быстро обезглавить с ножницами и падение в 70% этанола, и быстро выставить мозга с сагиттальной разрез черепа. Осторожно снимите мозга и сразу же в холодную DM. Отдельные его на два полушария и место каждого полушария медиальной стороной вниз на крышку губкой в ​​течение 2-3 секунд.
5. Аккуратно поднимите и место полушарии на Aclar квадратных фильма и место на ткани вертолет; вырезать мозг коронки в 350 мкм разделов. Когда закончите, осторожно извлечь квадратный Alcar с секционным полушарии и погрузить в холодную DM.
6. Использование рассекает микроскоп, выделить гиппокампа разделов. Для крыс, не должно быть 5 разделов охватывающих ростральнее хвостового гиппокампа, а также для мыши не должно быть 3-4 секций.
7. Выньте 6-луночных с мембраной вставками из 37 ° культуре ткани инкубатора. Передача срезах гиппокампа индивидуально на мембраны использованием пипетки стеклянные передачи. Если слишком много немецких марок выпускается на мембране, удалить излишки ДМ с пипетки Пастера. Место пять срезах гиппокампа на каждой мембраны. Позвольте по крайней мере 3 скважин в состояние, или 15 ломтиков.
8. Инкубируйте культуру пластин при 37 ° в 5% CO увлажненный инкубаторе в течение 12-14 дней до начала токсичности эксперимента. Культуральной среде может быть изменен дважды в неделю.

3. Стимулирование и Количественная гиппокампа нейронов травмы в фрагмент культуры

1. После 12-14 дней в области культуры, добавьте 5 мкг / мл пропидий йодида (PI) в культуральной среде. Этот шаг позволит визуализации и количественной оценки базальной клеточной смерти.
2. На следующий день, количественно PIфлуоресценции в субрегионе СА1 (и / или СА3 или зубчатые по желанию) каждого среза гиппокампа и получить среднее PI флуоресцентных измерений представляют базальной клеточной смерти (именуемые время = 0 часов, или T _0). Для получения изображения и количественное, мы используем OpenLab программное обеспечение (Импровизация, Великобритания), но и другие приобретения и анализа изображений программное обеспечение может быть использовано для количественной интенсивности флуоресценции.
3. Сразу же после захвата изображений из T ₀ PI флуоресценции, вызвать повреждение нейронов вашим методом выбора (мы воспользовались 10 мкМ NMDA-, кислород-глюкозы лишения или LPS в течение одного часа, чтобы вызвать нейронов токсичности ^2,5). После токсичных стимул, заменить средний свежей средой, содержащей 5 мкг / мл PI и поддерживать ломтиками ночь.
4. На 3-й день, количественно означает П. И. флуоресценции экспериментальных условиях на 24 часа, или _Т-24.
5. После этого захвата изображений, немедленно изменить средних и добавить 10 мкМ NMDA и 5 мкг / мл PI и инкубировать ломтиками ночь, чтобы добиться максимальной гибели нейронов.
6. На 4-й день, количественно означает П. И. флуоресценции максимальная гибель нейронов, определяемая как Т _макс. Рассчитать смерти процентов ячейки следующим образом: (Т ₂₄ - Т ₀₎ / (Т _{макс-T 0).}

4. Представитель Результаты

Рисунок 1. () Время линия для производства гиппокампа и последующей экспериментальной травмы и получения изображений. (B), представитель образы срезах гиппокампа у основания (T _0), 24 часов после 1 часа воздействия 10 мкМ NMDA (Т _24), а еще через 24 часа или 10 мкМ NMDA для получения максимального нейронов травмы (Т _макс).

Есть два важных момента, чтобы следовать, чтобы обеспечить воспроизводимость и устойчивые результаты при репликации экспериментов. Во-первых, важно, чтобы гиппокампа возрасте ломтиками по 12-14 дней до начала эксперимента. С ломтиком изоляции, существует значительная микроглии ответ, и микроглии оставаться включенным в течение некоторого времени, с возвращением к отдыхает разветвленной состояние, наступающее на 10-й день в пробирке ^3,6. Во-вторых, средняя П. И. интенсивность флуоресценции пропорциональна числу пораженных клеток ^4. Последовательная флуоресценции измеряется в трех временных точках: (я) при T _0, до NMDA или OGD стимуляции для измерения базальной уровней спонтанной гибели нейронов, (II) при Т _24, или 24 часов после стимуляции NMDA или OGD или других стимулов, и (III) при Т _макс, после окончательной обработки срезов с 24 часов ночи летальный лечения с 10 мкМ NMDA который производит максимальное количество гибели нейронов. Смерть процентов ячейки рассчитывается по формуле (Т ₂₄ - Т ₀₎ / (Т _{макс-T 0).} Очень важно, чтобы нормализовать каждый ломтик на себя, используя этот метод, потому что размер гиппокампа и экспрессии рецепторов глутамата и распределение существенно измениться при переходе от ростральнее хвостового мозга, и неспособность нормализовать каждый кусочек, чтобы само по себе может привести к искусственной данных .