תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

1. הכנה

לפני שמתחילים, להרכיב את מכשירי ניתוח הנדרש, דיסקציה התקשורת לתרבות, עכברושית 7 יום או גורים העכבר. הפרוטוקול זהה עבור העכבר ההכנות חולדה.

(I) חומרים וציוד

• מספריים הפעלה (אורך ישר 6 ", חתול # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
• מיקרו לנתח מספריים, (אורך 4 ", חתול # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
• פחמן פלדה דומון מלקטת (חתול # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
• השתנה "טרנספר" זכוכית pipettes (בחלק התחתון של פסטר פיפטה להסיר והחליקה קצה)
• הסרט Aclar פלסטיק לחתוך 2 "x 2" ריבועים (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)
• כיסוי ספוגים 4 על ידי 3 ב (קנדל, חתול # 3157, מנספילד, MA)
• 30 מ"מ Millicell מוסיף קרום (0.4 מיקרומטר; Millipore, בדפורד, מסצ'וסטס)
• Mcllwain המסוק רקמות עם להב פיפיות גילוח (המסוק McILwain רקמות, החברה Vibratome, סנט לואיס, מיזורי)
• מיקרוסקופ הפוך עם מצלמת CCD וניתוח תוכנה תמונה

(Ii) בינוני Dissection (DM, 1 ליטר ב-pH 7.3)

(Iii) תרבות בינוני (400 מ"ל)

(Iv) בעלי חיים

חולדה הישנה 7 יום או גורים העכבר לאחר הלידה, בדרך כלל אחד בכל המלטה הניסוי.

2. ביום התרבות

1. כל הכלים לנתיחה הסרט Aclar חייב להיות טבול ETOH 70% במשך 30 דקות לפני תחילת. פני השטח של מכסה המנוע לנתיחה, להב, וכן המסוק רקמה יש לחטא עם אתנול.
2. הכן מספר (3-4) 6 גם תרבות צלחות רקמות; להוסיף 1 מ"ל בינוני לכל תרבות היטב, להוסיף קרום חדיר Millipore היטב כל אחד. מקום 6 גם צלחות של 37 ° החממה עד מוכן להעביר את הפרוסות.
3. הכן מספר (4-6) 60 מ"מ צלחות עם DM ומניחים על קרח.
4. במהירות לערוף עם מספריים לטבול 70% ETOH, במהירות לחשוף את המוח עם חתך saggital הגולגולת. מוציאים בזהירות את המוח ואת המקום מיד DM קר. מפריד אותה לשני חצאי ומקום לכל צד האונה המדיאלי על ספוג כיסוי 2-3 שניות.
5. הרם בעדינות והנח את הכדור אל הכיכר הסרט מקום Aclar על המסוק רקמות; לחתוך את המוח coronally ב סעיפים 350 מיקרומטר. בסיום, בעדינות לקחת את הכיכר Alcar עם האונה לצלול מחולק וב DM קר.
6. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להפריד את הסעיפים בהיפוקמפוס. עבור החולדה, צריך להיות 5 חלקים פורש מקורי להיפוקמפוס הזנב, ועל העכבר צריך להיות בסעיפים 3-4.
7. קח את 6 גם צלחות עם קרום מוסיף מן הרקמה 37 ° התרבות בחממה. העברת פרוסות בהיפוקמפוס בנפרד על קרום חדיר בעזרת פיפטה העברת זכוכית. אם יותר מדי DM הוא שוחרר על הממברנה, להסיר עודף DM עם פיפטה פסטר. מקום חמש פרוסות בהיפוקמפוס על כל קרום. אפשר לפחות 3 בארות לכל מצב, או 15 פרוסות.
8. דגירה צלחות תרבות ב 37 מעלות ב CO החממה 5% humidified במשך 12-14 ימים לפני תחילת ניסוי רעילות. בינוני התרבות ניתן לשנות פעמיים בשבוע.

3. גרימת וכימות פגיעה עצבית בהיפוקמפוס בתרבות Slice

1. לאחר 12-14 ימים בתרבות, להוסיף 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​יודיד propidium (PI) לתקשורת ותרבות. צעד זה יאפשר להדמיה וכימות של מוות התאים הבזליים.
2. למחרת, לכמת PIהקרינה subregion CA1 (ו / או CA3 משוננת או במקרה הצורך) של כל פרוסה בהיפוקמפוס להשיג מתכוון מדידות הקרינה לצרכן המייצג המוות של התאים הבזליים (המכונה זמן = 0 שעות, או T _0). לרכישת תמונה וכימות, אנו משתמשים בתוכנות OpenLab (אימפרוביזציה, בריטניה), אך רכישת תמונה אחרת ותוכנה ניתוח יכול לשמש כדי לכמת את עוצמת הקרינה.
3. מיד לאחר רכישת התמונה של T ₀ PI הקרינה, לגרום לפגיעה עצבית לפי שיטת הבחירה שלך (השתמשנו 10 מיקרומטר NMDA, חמצן, גלוקוז קיפוח, או LPS במשך שעה אחת כדי לגרום לרעילות עצבית ^2,5). לאחר הגירוי רעילים, להחליף בינוני עם בינוני טרי המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​לצרכן ולשמור פרוסות לילה.
4. ביום 3, לכמת אומר לצרכן הקרינה של תנאי הניסוי ב 24 שעות, או טי _24.
5. לאחר רכישה זו התמונה, מיד לשנות בינוני ומוסיפים 10 מיקרומטר NMDA ו - 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​לצרכן ופרוסות דגירה לילה להשיג מוות עצבי מקסימלי.
6. ביום 4, לכמת אומר הקרינה לצרכן של מוות עצבי מקסימלי, כהגדרתו T _max. חישוב התא למוות אחוז כדלקמן: (ט ₂₄ - T ₀₎ / (T _{max-T 0).}

4. נציג תוצאות

איור 1.) A (קו זמן הדור של פגיעה ניסיוני בהיפוקמפוס ובעקבות רכישת התמונה. (ב) נציג תמונות של פרוסות בהיפוקמפוס basally (ט _0), 24 שעות לאחר חשיפה 1 שעה 10 מיקרומטר NMDA (ט _24), ואחרי 24 שעות או 10 מיקרומטר נוסף NMDA כדי להשיג פגיעה מירבית העצבית (ט _{מקסימום).}

ישנן שתי נקודות חשובות לעקוב כדי להבטיח תוצאות לשחזור ועקבית כאשר משכפלים ניסויים. ראשית, חשוב לתת את גיל פרוסות בהיפוקמפוס עבור 12-14 ימים לפני ניסויים. עם בידוד פרוסה, יש תגובה microglial משמעותית, microglia להישאר פעיל במשך זמן מה, עם חזרה למצב מנוחה ענפה מתרחשת ביום 10 במבחנה ^3,6. שנית, כלומר עוצמת הקרינה לצרכן הוא יחסי למספר תאים נפצעו ^4. הקרינה נמדדת רצופות בשלוש נקודות זמן: (i) ב T _0, לפני NMDA או גירוי OGD כדי למדוד את רמות הבסיס העצבי של מוות ספונטני (ii) ב _24-T, או 24 שעות לאחר גירוי עם NMDA או גירוי OGD או אחר, (iii) ב-T _מקס, לאחר הטיפול האחרון של פרוסות עם טיפול 24 שעות לילה קטלני עם 10 מיקרומטר NMDA אשר מייצרת את הכמות המקסימלית של מוות עצבי. מות התא אחוז מחושב ואז באמצעות הנוסחה (ט ₂₄ - T ₀₎ / (T _{max-T 0).} זה קריטי כדי לנרמל כל פרוסה על עצמו באמצעות שיטה זו בגלל גודלו של ההיפוקמפוס ואת הביטוי קולטן הגלוטמט ולשנות הפצה משמעותי אחד הולך מ מקורי למוח הזנב, ואת כישלון לנרמל כל פרוסה על עצמו עלול לגרום נתונים artifactual .