海马脑片的器官型检查神经元损伤的文化模式

1。制备

在开始之前，组装所需的手术器械，剥离和文化传媒，7日龄大鼠或小鼠幼仔。该协议是相同的小鼠和大鼠的准备。

（一）材料和设备

• 操作剪刀（直线长度6“，猫＃RS6818，Roboz，盖士堡，MD）
• 微解剖剪刀，（长度为4的“猫＃RS5910。Roboz，马里兰州盖瑟斯堡）
• 碳钢杜蒙镊子（猫＃RS - 5045.Roboz，盖士堡，MD）
• 改性玻璃“转让”的移液器（巴斯德吸管的底部和边缘平滑）
• ACLAR塑料薄膜切成2“× 2”（＃812071，霍尼韦尔，波茨维尔，PA在广场）
• 盖海绵3 4（肯德尔，猫＃3157，曼斯菲尔德，马）
• 30毫米Millicell小膜的插入（0.4微米; Millipore公司，贝德福德，马萨诸塞）
• Mcllwain组织菜刀双刃刀片（McILwain组织菜刀，Vibratome公司，圣路易斯，密苏里州）
• 倒置显微镜与CCD相机和图像分析软件

（二）解剖中等（DM; 1升pH值7.3）

（三）培养液（400毫升）

（四）动物

7日龄大鼠或小鼠产后幼仔，一般每一个实验的枯枝落叶。

2。在文化节

1. 所有清扫工具和ACLAR电影必须在70％乙醇浸泡30分钟才开始。夹层罩，刀片，并组织菜刀表面必须用乙醇消毒。
2. 准备几个（3-4）6孔组织培养板，每孔加入1 mL培养基，并插入一个Millipore公司在每口井的半透膜。广场6孔板，在37 °孵化器，直到准备转让片。
3. 准备几个（4-6）60毫米板与DM，并置于冰上。
4. 用剪刀快速斩首，浸在70％乙醇，并迅速暴露的大脑与颅骨矢状切口。小心地取出大脑和地点，立即在寒冷的DM。分成两个半球，每个半球的内侧，并放置在2-3秒的封面海绵。
5. 轻轻抬起并放置到ACLAR电影广场和地方组织菜刀半球;冠削减350微米的部分大脑。完成后，轻轻切片半球和淹没在寒冷的DM Alcar平方米。
6. 使用解剖显微镜，分离出海马的部分。老鼠，应该有5个部分，涵盖到尾鳍海马延髓，鼠标应该有3-4节。
7. 从37 °组织培养孵化器的膜插入，取出6孔板。海马单独转移到使用玻璃移液管的渗透膜。如果太多DM是释放到膜，除去多余的巴斯德吸管DM。每个膜放在五个海马。允许每个条件至少有3口井，或15片。
8. 孵育12-14天的培养板中毒性实验开始前，在5％二氧化碳培养箱，在37 °。培养基可以每周更换两次。

3。引导和量化切片培养的海马神经元损伤

1. 经过12-14天中文化，添加5μg/ mL的碘化丙啶（PI）的文化传媒。这一步将让基底细胞死亡的可视化和量化。
2. 翌日，量化的PI荧光每个海马脑片CA1区（和/或CA3区或齿状如果需要的话），并获得平均PI的荧光测量基底细胞死亡（称为时间= 0小时，或T _0）。图像采集和定量分析，我们使用的OpenLAB软件（即兴创作，英国），但其他图像采集和分析软件，可用于定量荧光强度。
3. 紧随图像采集_T +0 PI荧光后，由您所选择的方法（我们已经用了一小时10微米NMDA受体，氧糖剥夺，或LPS诱导神经元的毒性^2,5）诱导神经元损伤。有毒的刺激后，更换​​新鲜培养基培养基中含有5微克/毫升PI和维护切片过夜。
4. 在第3天，量化平均值PI荧光的实验条件下，24小时，或_T 24 。
5. 这个图像采集后，立即改变培养基，并添加10μmolNMDA和5微克/毫升的PI和孵化片过夜，以达到最大的神经元死亡。
6. 第4天，量化平均PI荧光最大的神经元死亡，定义为_T MAX。 ％的细胞死亡计算如下_：24（T - T _0）/（T MAX - _{T 0）} 。

4。代表性的成果

图1（A）代海马和随后的实验损伤和图像采集的时间线。 （二）代表图像基部海马（T _0），24小时暴露1小时后，10微米NMDA受体（T _24），并经过进一步的24小时或10微米的NMDA获得最大的神经元_损伤 （T MAX ）。

要遵循确保重复性和一致的结果，复制实验时，有两个重要的点。首先，重要的是让海马年龄为12-14天前实验。片隔离，是一个重大的小胶质细胞的反应，和小胶质细胞在一段时间内保持激活状态，回到休息分枝国家发生的第10 天， ^在体外3,6 ，。其次，意味着PI荧光强度成正比受伤的细胞数量^4。顺序荧光是在三个时间点：（一）在T ₀之前，NMDA或OGD刺激措施，自发的神经元死亡的基础水平，测量_;（ii）在T 24或24小时后，NMDA或缺氧缺糖或其他刺激刺激，及（iii）在_T MAX，切片后24小时10μMNMDA受体过夜致命的治疗产生的神经细胞死亡的最大金额的最终处理。然后计算公式（T ₂₄ - T _{0）/（T MAX} - T _0）％的细胞死亡。正常化每个切片本身，使用这种方法的关键，因为这是海马和谷氨酸受体的表达和分布的变化，作为一个显着的大小从延髓脑尾鳍，并未能正常化每个切片本身可能会导致artifactual数据。