El organotípicos rebanada hipocampo modelo de cultivo para el examen de la lesión neuronal

1. Preparación

Antes de comenzar, reunir los instrumentos que se requieren cirugía, la disección y medios de cultivo, y siete días de ratas de edad o crías de ratón. El protocolo es el mismo para el ratón y los preparativos de la rata.

(I) Los materiales y equipos

• Tijeras de operación (tramo recto de 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
• Micro Tijeras de disección, (longitud de 4 ", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
• Pinzas de acero al carbono Dumont (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
• Vidrio modificado con la "transferencia" pipetas (parte inferior de una pipeta Pasteur eliminado y se alisa el borde)
• Aclar película de plástico cortadas a 2 "x 2" en las plazas (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)
• Cubrir las esponjas 4 en el 3 en (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA)
• 30 mm Millicell inserta la membrana (0,4 m; Millipore, Bedford, MA)
• Mcllwain helicóptero de tejido con una hoja de afeitar de doble filo (chopper McIlwain tejido, la empresa Vibratome, St. Louis, MO)
• Microscopio invertido con cámara CCD y el software de análisis de imagen

(Ii) La disección media (DM, 1 litro a pH 7,3)

(Iii) medio de cultivo (400 ml)

(Iv) los animales

7 días de ratas de edad o crías de ratón postnatal, por lo general una camada al experimento.

2. En el Día de la Cultura

1. Todas las herramientas de disección y la película de Aclar deben ser empapados en EtOH al 70% durante 30 minutos antes de comenzar. La superficie de la campana de la disección, la cuchilla, y el chopper de tejidos deben ser desinfectados con etanol.
2. Prepare varias (3-4) 6 placas de cultivo de tejidos, añadir 1 ml de medio de cultivo por pocillo, e insertar una membrana Millipore permeable en cada pozo. Colocar placas de 6 pocillos en el 37 º incubadora hasta el momento de la transferencia de las rebanadas.
3. Prepare varias (4-6) 60 mm placas con DM y el lugar en el hielo.
4. Rápidamente decapitar con unas tijeras y baño en EtOH al 70%, y rápidamente exponer el cerebro con una incisión sagital del cráneo. Retire con cuidado el cerebro y el lugar de inmediato en frío DM. Separarlo en dos hemisferios y el lugar cada lado medial del hemisferio hacia abajo sobre una esponja cubierta por 2-3 segundos.
5. Con cuidado, levante y el lugar del hemisferio en la plaza película Aclar y el lugar en el helicóptero de tejido, cortar el cerebro coronal en 350 secciones micras. Cuando termine, quite suavemente la plaza Alcar con el hemisferio seccionado y se sumergen en el frío DM.
6. Utilizando un microscopio de disección, separar las secciones del hipocampo. Para ratas, no debe ser de 5 secciones que abarcan rostral a caudal hipocampo, y para el ratón debe haber secciones 3-4.
7. Sacar las placas de 6 pocillos con inserciones de la membrana de la 37 ° tejido incubadora cultura. Transferencia de rodajas de hipocampo de forma individual en las membranas permeables con la pipeta de transferencia de cristal. Si demasiado DM se libera en la membrana, eliminar el exceso de DM con una pipeta Pasteur. Coloque cinco rodajas de hipocampo de cada membrana. Deje por lo menos tres pozos por condición, o rodajas de 15.
8. Incubar las placas de cultivo a 37 ° en un 5% de CO incubadora humidificada durante 12-14 días antes de comenzar el experimento de toxicidad. El medio de cultivo se pueden cambiar dos veces por semana.

3. Inducir y cuantificación de lesiones del hipocampo neuronal en Cultura Cortar

1. Después de 12-14 días de cultivo, agregar 5 mg / ml de yoduro de propidio (PI) a los medios de cultivo. Este paso permitirá la visualización y cuantificación de la muerte de células basales.
2. Al día siguiente, cuantificar PIfluorescencia en la subregión CA1 (y / o CA3 o dentada, si lo desea) de cada rebanada del hipocampo y obtener decir las medidas de fluorescencia PI representa la muerte de células basales (en adelante, el tiempo = 0 horas, o T _0). Para la adquisición de imágenes y la cuantificación, se utiliza software Openlab (Improvisación, Reino Unido), pero la adquisición de imágenes y otros software de análisis puede ser utilizado para cuantificar la intensidad de fluorescencia.
3. Inmediatamente después de la adquisición de la imagen de T ₀ PI fluorescencia, inducen daño neuronal por el método de elección (se han utilizado 10 M de NMDA, el oxígeno de glucosa en la privación, o LPS durante una hora para inducir toxicidad neuronal ^2,5). Después del estímulo tóxicos, reemplace medio por medio fresco que contiene 5 mg / ml PI y mantener rebanadas durante la noche.
4. El día 3, cuantificar significa PI fluorescencia de la condición experimental a las 24 horas, o _T-24.
5. Después de esta adquisición de imágenes, de inmediato cambio de medio y añadir 10 M de NMDA y 5 mg / ml PI y las rodajas de incubar durante la noche para conseguir la muerte neuronal máximo.
6. El día 4, cuantificar media de fluorescencia PI de la muerte neuronal máxima, definida como T _max. Calcular la muerte celular por ciento de la siguiente manera: (T ₂₄ - T ₀₎ / (T _{max-T 0).}

4. Resultados representante

Figura 1. (A) de la línea de tiempo para la generación de una lesión experimental del hipocampo y la posterior y la adquisición de la imagen. (B) Imágenes representativas de rodajas de hipocampo basal (T _0), 24 horas después de una exposición de 1 hora a 10 M de NMDA (T _24), y después de otros 24 ó 10 M de NMDA para obtener una lesión neuronal máxima (T _max).

Hay dos puntos importantes a seguir para asegurar resultados reproducibles y consistentes al replicar los experimentos. En primer lugar, es importante que la edad rodajas de hipocampo de 12-14 días antes de la experimentación. Con el aislamiento de corte, hay una respuesta microglial significativa, y microglia permanecerá activada durante un tiempo, con un retorno a un estado de reposo ramificado que ocurre a los 10 días in vitro ^3,6. En segundo lugar, la intensidad media de fluorescencia PI es proporcional al número de las células lesionadas ^4. Secuencial de fluorescencia se mide en tres momentos: (i) a T _0, antes de NMDA o la estimulación OGD para medir los niveles basales de la muerte neuronal espontánea, (ii) en el T _24, o 24 horas después de la estimulación con NMDA o estímulo OGD u otros, y (iii) en el T _max, después de un tratamiento final de las rebanadas con un tratamiento de 24 horas durante la noche letal con 10 M de NMDA que produce la máxima cantidad de la muerte neuronal. La muerte celular por ciento se calcula mediante la fórmula ₍₂₄ T - T ₀₎ / (T _{max-T 0).} Es fundamental para normalizar cada rebanada a sí mismo utilizando este método, porque el tamaño del hipocampo y la expresión del receptor de glutamato y el cambio de distribución de manera significativa al pasar del rostral a caudal del cerebro, y la falta de normalización de cada rebanada de sí mismo puede resultar en datos de un artefacto .