Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

1. Hazırlık

Başlamadan önce, gerekli cerrahi aletler, diseksiyon ve kültür ortamı, ve 7 gün eski sıçan veya fare yavrular monte edin. Protokol, fare ve sıçan hazırlıkları için aynıdır.

(I) Malzeme ve ekipman

• İşletim makas (düz uzunluğu 6 ", kedi # RS6818 Roboz, Gaithersburg, MD)
• Micro makas, diseksiyon (uzunluk 4 ", kedi # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
• Karbon Çelik Dumont Cımbız (kedi # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
• Modifiye cam "transfer" pipetler (kaldırıldı Pasteur pipeti alt ve kenar düzeltti)
• Aclar plastik film meydanlarda (Honeywell, # 812.071, Pottsville, PA) "x 2" 2 kesilmiş
• Kapak 3 sünger 4 (Kendall, kedi # 3157, Mansfield, MA)
• 30 mm Millicell membran ekler (0.4 mikron; Millipore, Bedford, MA)
• Iki ucu keskin bir jilet (McILwain doku kıyıcı, Vibratome Şirket, St Louis, MO) Mcllwain Doku kıyıcı
• CCD kamera ve görüntü analiz yazılımları ile inverted mikroskop

(Ii) Diseksiyon Orta (DM; pH 7,3 az 1 litre)

(Iii) Kültür ve orta (400 ml)

(Iv) Hayvanlar

7 gün eski sıçan veya fare postnatal yavrular, genellikle Deneme başına bir çöp.

2. Kültür Günü

1. Tüm diseksiyon aletleri ve Aclar film başlamadan önce 30 dakika boyunca% 70 ETOH batırılmış olmalıdır. Diseksiyonu kaput, bıçak ve doku kıyıcı yüzey etanol ile dezenfekte edilmelidir.
2. (3-4) birkaç 6 sıra doku kültürü plakaları hazırlamak; ortalama 1 ml kültür ortamı ekleyin ve her kuyuda bir Millipore geçirgen zar takın. 37 koyun 6-kuyucuğu ° inkübatör dilim aktarmak için hazır olana kadar.
3. DM ve buz üzerinde yer ile birkaç (4-6) 60 mm tabak hazırlayın.
4. Hızla başını kesmek makas ile ve% 70 ETOH daldırma ve beyin, kafatasının bir saggital kesi ile hızlı bir şekilde ortaya çıkarmak. Dikkatle soğuk DM beyin yeri ve hemen çıkarın. Iki yarımküresinin içine ayırın ve 2-3 saniye için bir kapak sünger üzerinde, her yarımkürede medial yerde.
5. Yarıkürede doku kıyıcı Aclar film kare yer ve üzerine yavaşça kaldırın ve yeri; 350 mikron bölümlerde koronal beyin kesmek. Bittiğinde, yavaşça ALCAR kare kesitli soğuk DM yarımkürede ve batığın alır.
6. Diseksiyon mikroskop kullanarak, hipokampal bölümlere ayırın. Sıçan için, kaudal hipokampus rostral kapsayan 5 bölümden olmalıdır ve fare için 3-4 bölüm olması gerekir.
7. 37 ° doku kültürü inkübatör membran ekler ile 6-kuyucuğu çıkartın. Hipokampal dilimleri ayrı ayrı cam transferi pipet kullanarak geçirgen membranlar üzerine aktarın. Çok DM membran üzerine bırakılırsa, Pasteur pipeti ile DM fazla çıkarın. Her membran beş hipokampal dilimleri yerleştirin. Başına en az 3 kuyu, durum ya da 15 dilim izin verin.
8. Toksisite deney başlamadan önce 12-14 gün için% 5 CO nemlendirilmiş inkübatör 37 ° kültür plakaları inkübe edin. Kültür ortamı haftada iki kez değiştirilebilir.

3. Dilim Kültür Hipokampal Nöronal Yaralanma uyaran ve miktarının

1. Kültür 12-14 gün sonra 5 mg / ml propidium iyodür (PI), kültür ortamı ekleyin. Bu adım, görselleştirme ve bazal hücre ölümü ölçümü sağlayacaktır.
2. Ertesi gün, PI ölçmekher hipokampal dilim CA1 subregion (ve / veya CA3 veya dentat istenirse) floresans ve elde PI floresans ölçümleri bazal hücre ölümü (zaman olarak adlandırılır = 0 saat, ya da T ₀₎ temsil eden anlamına gelir. Görüntü elde etme ve ölçülmesi için, biz openlabın yazılımı (Doğaçlama, Birleşik Krallık), ancak diğer görüntü toplama ve analiz yazılımı floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılabilir.
3. T ₀ PI floresan görüntü elde etme hemen sonra, seçtiğiniz yöntem (biz nöronal toksisite ^2,5 ikna etmek için bir saat 10 mcM NMDA, oksijen-glikoz yoksunluk, veya LPS) nöronal hasara yol. Toksik uyaran sonra, 5 mg / ml PI içeren taze orta orta yerine ve geceleme dilim korumak.
4. 3 gün, ortalama PI 24 saat deneysel durumun floresan veya T ₂₄ belirlenir.
5. Bu görüntü alımından sonra hemen orta değiştirmek ve 10 mcM NMDA ve 5 mg / ml PI ve maksimal nöron ölümü elde etmek için gece boyunca inkübe dilimleri eklemek.
6. 4 gün, ortalama _Tmax olarak tanımlanan maksimum nöronal ölüm PI floresan ölçmek. Aşağıdaki gibi yüzde hücre ölümü hesaplayın: (T ₂₄ - T ₀₎ / (T _{max-T 0).}

4. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 (A) Zaman deneysel yaralanma ve görüntü alımı, hipokampus ve sonraki nesil için. (B) hipokampal dorsalde dilimleri (T _0), 24 saat 10 mcM NMDA (T ₂₄₎ 1 saat maruz kalma ve NMDA maksimum nöronal hasarı _{(T max)} elde etmek için daha ileri bir 24 saat ya da 10 mcM. Temsilcisi görüntüleri

Deneyler kopyalayan tekrarlanabilir ve tutarlı sonuçları elde etmek için izlemeniz gereken iki önemli nokta vardır. İlk olarak, 12-14 gün önce deney için hipokampal dilim yaş izin vermek önemlidir. Dilim yalıtımı sayesinde, önemli bir mikrogliyal yanıt vardır ve mikroglia in vitro ^3,6 10 günde meydana gelen bir dinlenme dallanmış devlet bir dönüş, bir süre aktif kalır . İkincisi, PI floresan yoğunluğu, yaralı hücrelerinin ^sayısı 4 ile orantılıdır anlamına gelir . Sıralı floresan üç zaman noktalarında ölçülür: (i) T _0, NMDA veya spontan nöronal ölüm bazal düzeylerini ölçmek için OGD stimülasyon önce NMDA veya OGD veya diğer uyaran ile uyarılması (ii) T ₂₄ veya 24 saat sonra, ve (iii) T _max, maksimum miktarda nöronal ölüm üreten 10 mcM NMDA ile birlikte 24 saat gecede öldürücü tedavi ile nihai bir tedavi dilim. / (T _{max-T 0)} - yüzde hücre ölümünden sonra (T ₀ T ₂₄₎ formülü kullanılarak hesaplanır. Biri olarak önemli ölçüde hipokampus ve glutamat reseptör ekspresyonu ve dağıtım değişikliği boyutunu rostral kaudal beyin ve kendisi için her dilim normalleştirmek için bir başarısızlık gider çünkü bu yöntemi kullanarak, kendisi için her dilim normalleştirmek için kritik artefakt veri neden olabilir .