Patch Clamp Inspelningar från mus näthinnan nervceller i en anpassad Dark-Slice Förberedelser

1. Förbereda Elektroder

1. Förbered inspelning och referens elektroder genom att doppa dem i både 1M NaCl och köra 15V mellan dem med hjälp av en 1 Hz sinusvåg för ~ 20 s.
2. Gör inspelningen elektroderna med en mikropipett avdragare (Sutter Instruments P-97). För patch-pipetter använda ett borosilikatglas med en yttre diameter på 1,2 mm och en innerdiameter på 0,69 mm (Sutter Instrument, Cat # B120-69-10). Mät serien motståndet genom spetsen på elektroden. Utifrån storleken på målceller välja en pipettspetsen diameter, för cell organ ~ 20 mikrometer i diameter använda ~ 5 Mohm för cell organ ~ 5 mikrometer i diameter använda ~ 12 Mohm.
3. Förbered marken / referens elektroder. Med hjälp av en spruta fylla en liten slang avsnitt polyeten (Intramedic, PE205) med 1 mM NaCl som innehåller 3,5% agar (Sigma, Cat # A7002) i 1M NaCl. Placera denna agar bro över Ag / AgCl referenselektrod.

2. Förbereda Lösningar

1. Extern bad lösning, Ames media som innehåller bikarbonat (1 L): 1 flaska Ames Medium (Sigma, Cat # A1420), 1,9 g NaHCO _3, 7 mL Penicillin-streptomycin (Sigma, Cat # P0781) för att förhindra bakteriell tillväxt. Justera osmolaritet till ~ 280 mOsm.
2. Skivning lösning, Ames media som innehåller den HEPES pH-buffert (1 L): 1 flaska Ames Medium, 0,887 g NaCl, 2,38 g HEPES, 7 ml Penicillin-streptomycin. Justera pH till ~ 7,4 med 1M NaOH och / eller 1M HCl. Justera osmolaritet till ~ 280 mOsm.
3. Kalium-aspartat (K-ASP) pipett intern lösning (i mm): 125 K-aspartat, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl _2, 1 ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg, är pH-justeras för att ~ 7,3 med NMG-OH, och osmolaritet anpassas till ~ 280 mOsm.
4. Agar backspärr för att stabilisera låg agaros gelbildande temperatur innehåller näthinnan (5% av vikten), 7,5 g Agar (Sigma, Cat # A7002) smälts i 150 ml dH ₂ O.

3. Day of Experiment

1. Tina ~ 1,5 ml K-Asp intern lösning och fluoroforen av dina val från frysen. Späd fluoroforen till lämplig koncentration, som bör bestämmas empiriskt.
2. Häll Ames media som innehåller NaHCO ₃ (~ 200 ml) i ljuset tätt förråd och sedan placera i vattenbad (30-32 ° C) och jämvikt med 5% CO ₂ / 95% O ₂ gas
3. Fyll flaskan med ~ 110 ml Ames media som innehåller HEPES, lägg på is och jämvikt med 100% O _2.
4. Placera den återstående Ames media som innehåller NaHCO ₃ i ett uppvärmt reservoar på toppen av Faradays bur, och balansera med 5% CO ₂ / 95% O ₂ gas. Parafilm kan användas för att fånga gasen i utrymmet ovanför lösningen.
5. Förbered låga agarosen gelbildande temperatur (3%) genom att tillsätta 0,75 g (Sigma, Cat # A0701) till 25 ml av Ames media med HEPES och värme lösningen vid ~ 115 ° C för att smälta agaros. Rör tills lösningen klar utan bubblor, och förvara i ett vattenbad (~ 42 ° C).
6. Fyll en inspelning pipett med K-Asp intern lösning och kontrollera spetsen motstånd.

4. Börja Experiment

1. Euthanize musen och snabbt ta bort ögonen med böjd sax. Infraröd skyddsglasögon bör användas för alla rutiner för att förhindra blekning av visuella pigment.
2. Lägg ögonen på en bit filterpapper för att hindra dem från att rulla, och med hjälp av en tunn dubbelsidig kniv, gör ett snitt i hornhinnan medan du håller ögat med pincett.
3. Så snart ögongloben är punkterad, överföra de öga i en skål fylld med Ames medier.
4. Använda springa i hornhinnan som inkörsport, små saxar används för att skära bort de återstående delarna av hornhinnan, varefter linsen och glaskroppen kan tas bort. Var försiktig så att näthinnan sitter kvar på ögonmusslan och lagra ögonmusslan i mörker vid 32 ° C i Ames media jämvikt med 5% CO ₂ / 95% O _2.

5. Skivning

1. Hemisect en av ögonmusslor och skilja näthinnan från pigmentepitelet. Ta bort kanterna på näthinnan så att vävnaden att ligga raklång.
2. Använd ett litet glas pasteurpipett med en latex glödlampa för att fylla en 35 mm petriskål med smält agar och dra pincetten över genom agar att testa dess konsistens.
3. När du kan börja se agar stelna:
   1. Överför näthinnan till toppen av agar.
   2. Använd en tvinnad bit Kimwipe att absorbera överflödig lösning runt näthinnan.
   3. Plats 2-3 droppar Agar direkt på näthinnan och snabbt placera en plastcylinder över näthinnan för att bilda en mur runt den. Droppa sedan ytterligare smälts agar ner sidorna av plast cylindern samtidigt centrering näthinnan i agar.
   4. Överför petriskål to ett bad isvatten att svalna.
4. Efter ~ 45 sekunder bort vävnad från isen vattenbad och använd en kolv att pressa den agar blocket ur plastcylinder, skjuta från sidan längst bort från näthinnan.
5. Använd den ensidiga rakblad för att skära ut en liten block av agar innehåller näthinnan och superlim blocket på plats mot agar backspärren på provet skivan.
6. Överför provet skivan till den vibrerande mikrotomen facket och häll iskallt Ames HEPES i facket gör att blocket med näthinnan vara helt nedsänkt.
7. Retinala skivor med en tjocklek på ~ 200 ìm kan klippas vid maximal bladet vibrerande ränta och en framåt knivhastighet in så att det tar 4 till 5 sekunder att skära igenom näthinnan på varje skiva.
8. Använd en nr 11 skalpell blad för att ta bort alla användbara bit i taget
9. Bra skivor som innehåller näthinnan placeras i inspelning kamrarna och viktas ned med slice ankare med nylon trådar korsa dem. Den nylon trådar håll ned agar omgivande näthinnan, lämnar näthinnan obehindrat för inspelningar.
10. Överför inspelningen kammaren till stadium i upprätt mikroskop, stäng gardinen och slå på infraröd ljuskälla för att visa segmentet på en infraröd-känslig kamera.

6. Inspelning

1. När en bra retinala slice (med intakt fotoreceptorer och lämplig skärvinkeln) identifieras börjar perfusing näthinnan i en takt högre än 5 ml / min med uppvärmd Ames media som är uppvärmd till 35 37 ° C och jämvikt med 5% CO ₂ / 95% O _2.
2. En del ytskador kan vara synliga på grund av skivning processen. Detta brukar tunt lager av celler kan tas bort med en pipett med en bruten spets, och försiktigt suga bort de döda cellen kroppar. Detta kommer vanligtvis att avslöja levande celler under. Identifiera en frisk cell kropp vars ställning ligger i skikt av intresse.
3. Fyll en mikropipett med KASP intern lösning och tillämpa positiv (utåt) trycket genom spetsen på pipetten, och lägre spetsen på pipetten i inspelningen kammaren och ned till nivån i cellen med hjälp av en mikromanipulator.
4. Flytta pipettspetsen så att det gropar cellmembranet och försiktigt negativ (inåt) tryck för att göra en hög resistans tätning. Hela cell-läge kan uppnås genom att använda negativa trycket till elektroden att bryta sig in i cellen.
5. Stimulera näthinnans vävnad med hjälp av lysdioder kan sedan framkalla reaktioner på ljus.
6. Fotografera den cell från vilken inspelningen gjordes av frammana fluorescens från fluoroforen i pipetten intern lösning.

7. Representativa resultat

Figur 1. Här, ljus-framkallade potentialer i en mörk anpassad näthinnan neuron till ljusblixtar av ökande styrka visas är.

Figur 2. Fluorescens bild från en retinal skiva där celler har fyllts med fluoroforen, Lucifer Gul. Frammanade fluorescens visar morfologi av celler från vilken patch inspelningar gjordes.

Skär inspelning från ryggradsdjur näthinnor har gjorts i årtionden ^1,2, och har varit ganska framgångsrika i att ge en djupare förståelse av hur näthinnans kretsarna kodar infallande ljus. Fördelarna med att skära med en vibrerande mikrotom snarare än direkt med ett rakblad är att näthinnans skivor drabbas mindre skador på ytan. Med ett sug pipett är det lätt att ta bort denna skada och målet friska celler strax under ytan som har kvar sin anslutning i näthinnans krets, där de flesta celltyperna har identifierats ^5,6, och att visa robust svar på ljus. Således patch clamp inspelningar från mörkt anpassade retinal skivor kan låta en utredare att bestämma roller identifieras cellen klasser i neurala beräkningar.