Valutazione della immunologicamente rilevanti dinamiche Caratteristiche strutturali del terziario di HIV-1 sequenza R2 Loop Corona V3 da Ab initio Pieghevole

1. Metodologia

1. Il primo passo del protocollo è quello di selezionare la sequenza V3 corona vuoi mischiare in silico. Per il ceppo R2, la sequenza di questo frammento è KSIPMGPGRAFYT.
2. Atomica la struttura 3D del peptide corrispondente a questa sequenza dovrebbe essere costruito in uno spazio virtuale del computer. Il comando ICM per questo è:
   buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
   o File: Nuovo: peptidi può essere selezionato con il menu a discesa
3. Diversi parametri della procedura sono quindi impostare, compreso il numero di passi di ricerca (durata della ricerca), la temperatura di simulazione, parametri di strategia di ricerca prevede un contenimento della variabile per polarizzare la ricerca verso ambiti ragionevoli, i termini di energia, la selezione di diversi metodi di calcolo di energia, e dei parametri che indicano come la ricerca verrà registrato come se registrare un film e quanti conformazioni punteggio intermedio deve essere registrato. Tutti questi parametri sono stati ottimizzati da pubblicazioni precedenti (vedi www.molsoft.com).
4. Il pieghevole è poi iniziata con il comando:
   montecarlo
   o File: Nuovo: peptidi può essere selezionato con il menù a tendina Meccanica molecolare: Minimizza: Globale
   
   Nel primo caso, i parametri dal punto 3 deve essere impostato uno per uno nella riga di comando. In quest'ultimo caso, caselle di controllo per i parametri più comunemente scelti sono forniti in un riquadro prima che il comando viene eseguito. Per comodità, lo stesso copione pieghevole ICM utilizzati per questo esperimento e gli esperimenti precedentemente pubblicato è il seguente:
   
   Questo script può essere salvato in un file di testo ed eseguire da linea di comando del computer il sistema operativo (di solito LINUX) rapidamente, utilizzando il comando:
   icm _foldingscript
   

2. I segreti del successo

1. Il ciclo V3 è una costante 35 aminoacidi di lunghezza in quasi tutti i ceppi noti, così la posizioni di aminoacidi sono numerati 1-35 a partire dal solfuro di origine legato cistina a 1 e termina con il disolfuro corrispondente legato cistina a 35. Dal momento che è parte di un ciclo, i confini della corona di V3 dovrebbe essere scelti con cura. Se troppo grande un frammento è scelto, è improbabile che si comportano come un segmento flessibile liberamente come se si trattasse di un peptide libero, quindi la simulazione di piegatura non valutare correttamente la struttura. Se è troppo piccolo un frammento viene scelto, la struttura informativa terziaria non possono formare nella simulazione. Il nostro studio precedente ha mostrato che il frammento dalla posizione 10 alla posizione 22 correlata con l'anticorpo legato conformazioni cristallografica, quindi questo è il frammento di un ciclo V3 che dovrebbero essere scelti per la piegatura.
2. Anche se i menu utilizzando l'interfaccia utente grafica e pull-down è user-friendly, l'opera prima del successo sul folding di peptidi, in generale, usando ICM e V3 anello corona pieghevole in particolare utilizzato lo script di cui sopra, semplicemente modificando la sequenza nella linea buildpep ed eseguendo il script di cui sopra dalla linea di comando è raccomandato.

3. Rappresentante Risultati

I risultati per la piegatura R2 sono rappresentativi dei risultati per ogni ciclo V3. Per valutare i risultati, il file di progetto (che sarà chiamato "newProject1.icb" dallo script di cui sopra) deve essere aperto e "Meccanica molecolare, Catasta, Vista" scelto. Una tabella delle conformazioni dello stack apparirà. Le conformazioni stack può essere visualizzato graficamente cliccando sul Plot / Istogramma icona. "Molecular Mechanics, Catasta, Play" farà un film dello stack di apprezzare visivamente le preferenze conformazionali scoperto dalla piegatura. Per la sequenza R2, è la conformazione beta-hairpin-like come previsto per V3 loop ² - soprattutto nel frammento alle posizioni 12-14, dove si vede una chiara β-strand preferenza per tutta la pila, e pochissimi alfa-elica conformazioni sono visti. Inoltre, un gap di energia di quasi 3 unità è vista tra la conformazione di energia più bassa e la seconda conformazione di energia più bassa. Da un punto di vista energetico, questo significa che la struttura solo guizzi fuori dalla conformazione più bassa energia meno dell'uno per cento del tempo: i risultati folding quindi suggeriscono che la R2 V3 corona è un rigido, piuttosto che flessibile, la struttura. Ci possono essere ulteriori importanti caratteristiche strutturali l'insieme delle conformazioni, ma sono difficili da apprezzare in modo sistematico.

Tabella 1: neutralizzazione relativa JRFL e R2 V3 loop in ambienti con e senza maschera. I dati sono stati precedentemente riportati in Cardozo T., et al. ARHR (2008) e Pinter, A., et. al J. Virol (2004). In breve, attività neutralizzante è stato determinato con un unico ciclo di prova di infettività utilizzando PSV generato con il env-difettoso luciferasi che esprimono pNL4-3.Luc.RE-plasmide pseudotyped con il Env JRFL o il SF162 varianti V3 sopra descritte: SF162_V3JRFL contiene il JRFL V3 sequenza cappio al posto della sequenza SF162 ciclo V3. SF162_V3R2 contiene il V3 sequenza R2 cappio al posto della sequenza SF162 ciclo V3. Il PSV sono state incubate con diluizioni seriali del 447-52D mAb per 1,5 ore a 37 ° C, e poi aggiunto al CD4 + CCR5 + U87 cellule bersaglio placcato in piastre da 96 pozzetti in presenza di polibrene (10 mg = ml). Dopo 24 ore, le cellule sono state refed con media RPMI contenente 10% FBS e 10 mg = ml polibrene, seguite da altre 24-48 ore di incubazione. Attività luciferasi è stata determinata 48-72 postinfection h con un luminometro micropiastra (HARTA, Inc.) utilizzando reagenti da titoli dire Promega, Inc. geometrica per il 50% neutralizzazione (GMT50) da 447-52D sono stati determinati mediante interpolazione dalle curve di neutralizzazione e sono medie di almeno tre saggi indipendenti.

Pieghevole ab initio rivela terziario proprietà strutturali, i cui effetti potrebbero non essere evidente dallo studio di singoli aminoacidi in sequenza. Diverse proprietà strutturali già oscura del V3 R2 ciclo corona sono rivelate dalla simulazione di piegatura. Queste preferenze osservato strutturali necessariamente correlato a quello osservato proprietà funzionali del ceppo R2, cioè sensibilità alla neutralizzazione e hyperinfectivity ^5.

In primo luogo, una chiara tendenza filo β-N-terminale della corona V3 R2 in posizioni 12-14 si osserva. Questa è la posizione del ceppo R2 è insolito isoleucina-prolina-metionina (IPM) sequenza. Dalle strutture cristallografiche del 447-52D, 2219, Be48, 2557, 2558 e 537-D anticorpi anti-V3 ciclo legato a peptidi ciclo V3, le posizioni da 12 a 14 il loop V3 sono vincolati da questi anticorpi, e, quando si lega, il segmento adotta un locale β-strand di conformazione. La simulazione pieghevole suggerisce quindi che il V3 R2 ciclo corona preferisce una conformazione alle posizioni 12-14 che è complementare al noto anti-V3 loop di anticorpi neutralizzanti. Questa preferenza può spiegare la sensibilità osservate per la neutralizzazione di questo ceppo.

In secondo luogo, la simulazione mostra un gap di 3 unità di energia tra la conformazione di energia più bassa e la seconda conformazione di energia più bassa, il che suggerisce una struttura rigida. Gp120 di HIV-1 è una molecola estremamente dinamico, che richiede un grande cambiamento conformazionale dalla sua non legato, immunologicamente protetta (unliganded) forma al suo recettore umano legato e immunologicamente esposte (liganded) forma. La flessibilità del loop V3 può essere richiesto per effettuare questa transizione cooperativa, e la rigida struttura V3 R2 ciclo osservato qui può resistere spostamento del modulo di liganded, proprio come un blocco rigido potrebbe essere più difficile a scomparsa in un piccolo spazio rispetto al un blocco morbido flessibile. Questa resistenza ad adottare la forma unliganded può esporre ciclo V3, il sito di legame CD4 e CD4 indotto epitopi di neutralizzazione, che sono tipicamente esposti in forma liganded di gp120. Così, la rigidità osservata può anche essere concettualmente collegata alla sensibilità neutralizzazione osservato del ceppo R2.

Dato che il co-recettore interagisce forma del loop V3 è anche probabile che sia un β-tornante come le forme mirate di anticorpi neutralizzanti, i risultati suggeriscono che la corona R2 V3 è bloccato in co-recettore e la forma di anticorpi neutralizzanti complementari, che a sua volta può favorire la gp120 tutto nella sua forma liganded, rendendo il ceppo altamente infettivi. Così, la preferenza conformazionale osservato e rigidità sia può anche essere concettualmente associati hyperinfectivity R2.

Questa disposizione di una rigida, ma esposto co-recettore e di anticorpi conformazione complementare del ciclo V3 è distinta da quella di un flessibile, ma sepolto o mascherato ciclo V3 che è tipico di ceppi di HIV. Piegatura del ceppo JRFL (che espone il sottotipo B consenso da HIV-1 sequenza V3 loop) mostra anche una β-strand preferenza, ma molte conformazioni strettamente distribuita di energia più bassa suggestivi di flessibilità V3 corona (dati non riportati). La previsione è che questa sequenza ciclo V3 sarebbe molto sensibile alla neutralizzazione di un anticorpo adeguate, come la 447-52D se sono stati esposti, invece di sepolto. Come previsto, le sequenze JRFL e R2 sono ugualmente sensibili quando sono presentati in un ambiente esposto all'interno di un chimerico SF162 pseudovirus in cui viene sostituito il loop V3 dal JRFL o R2 V3 loop (Tabella 1), ma lo stesso loop V3 JRFL è completamente insensibile di neutralizzazione, quando ha presentato nel suo contesto nativo JRFL.

Questi risultati suggeriscono che la sequenza IPM insolita del ceppo R2 conferisce un rigido legame anticorpo-site-compatibile, co-recettoriale-site forma compatibile nella regione corona chiave del ciclo V3. La rigidità è ipotizzato di ostacolare la flessibilità conformazionale della gp120 come le transizioni tra le forme liganded e unliganded, chiusura che in gran parte nella sua forma liganded dove è esposta la forma anticorpi ottimale, co-recettore-ottimale nella corona V3 e disponibile. Il risultato è la sensibilità di neutralizzazione e hyperinfectivity del ceppo R2. In questo modo, l'esperimento ab initio pieghevole descritte in questo protocollo è informativo per la ricerca sul vaccino HIV: i risultati osservati pieghevole per R2 qui può essere importante per l'HIV-1 la progettazione di vaccini immunogeno come un indizio di come bloccare gp120 basata immunogeni in preferito , neutralizzazione conformazioni sensibili.