Erkennung von Neu1 Sialidase-Aktivität bei der Regulierung der Toll-like-Rezeptor-Aktivierung

1. Resurrecting Gefrorene Makrophagen

1. Vor Wiederbelebung eingefrorenen Zellen aus dem -80 ° C Gefrierschrank, muss man Kulturmedium Verwendung sterilfiltriert Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 5 g / ml plasmocin ergänzt vorzubereiten. Plasmocin ist eine Antibiotika-Lösung in unsere Forschung zur Beseitigung und Vermeidung von Mykoplasmen-Kontaminationen von Zellkulturen.
2. Für ein Fläschchen von gefrorenen Zellen gibt man 4 mL, 1 mL der kultivierten Medium bis zu einer 25 cm ² Zellkulturflasche in ein steriles biohazard Containment Kapuze.
3. Wenn die Flasche mit der eingefrorenen Zellen aus dem -80 ° C Gefrierschrank genommen werden, werden sie schnell von Hand Erwärmung in den sterilen Haube, die etwa 2-3 min dauert aufgetaut.
4. Sobald die Zellen aufgetaut sind, sind sie schnell in den Kolben mit dem konditionierten Medium mit einer 1 ml sterilen Pipette übertragen.
5. Die Flasche mit den Zellen werden in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C und 5% CO ₂ platziert.
6. Die Zellen für das Wachstum und die Einhaltung täglich überprüft, bis sie 75% bis 90% konfluent mit einem inversen Mikroskop werden.
7. Während der Zellkultur Inkubation, 12 mm runde Glasplatten durch Abdecken in 70% igem Ethanol in einem großen Glas-Petrischale für 1 Stunde in den Biohazard Containment Gehäuse sind sterilisiert, wird der Alkohol nachträglich entfernt und gespeichert reusage, und das nasse Glas Seiten bleiben ausgesetzt, um die sterilfiltriert Luftstrom im Gehäuse unter einer UV für 24 Stunden oder bis sie trocken sind.

2. Plating Cells für das Sialidase Assay

1. Vor der Beschichtung der Zellen ist eine einzige sterile runde Glasplatte sorgfältig in eine Vertiefung einer BD Falcon 24-well Flachboden mit Deckel Gewebekultur-behandelte Polystyrol Platte gelegt mit einem sterilisierten flammenden voll gebogen, 4 ", gezahnt, Edelstahl ForceP . Zum einen Kolben von Zellen bei 75% Konfluenz verwenden wir im Allgemeinen 12 Wells der Kulturplatte.
2. Für adhärente Makrophagen, die DMEM konditioniertem Medium aus der Flasche mit einer 5 mL sterilen Pipette in die sterile Containment Gehäuse entfernt werden. Waschen Sie die adhärenten Zellen einmal mit 1x Tris sterile Kochsalzlösung pH 7,4 auf jedem Serum enthaltenden Medium zu entfernen, und fügen Sie 1 ml Calcium-freien Medium (CMF) Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei pH 7,4 genug, um die Zellen zu decken. Die Zellen sind in der 37 ° C Inkubator für etwa 10 min oder in Verkehr gebracht, bis die Zellen zum Abheben in die Flasche zu beginnen. Der Kolben kann sanft geschaukelt werden oder geschüttelt, um alle verbleibenden adhärenten Zellen zu lösen.
3. Um die 1 ml suspendierten Zellen in der Flasche, 3 ml DMEM konditioniertem Medium. Nehmen Sie 0,5 ml der suspendierten Zellen und steril übertragen sie auf das Gewebe gezüchtet Platte mit den 12 mm runden Glasplatten. Rund, 0,5 x 10 ⁶ Zellen, die runde Glasplatten übertragen.
4. Die Gewebekulturplatte enthaltenden Zellen bei 37 ° C in 5% CO ₂ für 24 Stunden, damit für die Zellen, die runde Glasplatten haften.

3. Sialidase Assay

1. Dass die Kontrolle

1. Legen Sie einen Objektträger (gefrostet: 1 Ende, 1Schieben, 25 x 75 x 1 mm) in der Containment-Schrank oder Labortisch und fügen durch Mischen in der angegebenen Reihenfolge die folgenden Verbindungen: 1 ul DAKO + 1 ul der 4-Muñana und schließlich + 3 ul Tris-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (TBS).
2. Nach dem Entfernen der Medien aus einer gut mit den Zellen, heben die kreisförmige Glasplatte mit den 4 "ForceP um die Ecke des Brunnens. Entfernen Sie vorsichtig das Glas Folie mit dem ForceP und legen Sie die Folie mit dem Zellen nach auf die Mischung Lösung auf dem Objektträger.
3. Sofort nehmen die microcope slide zu einem epi-Fluoreszenz-Mikroskopie, die für die UV-Filter gesetzt wurde und verfügt über eine digitale Kamera für die Aufnahme der fluoreszierenden Bildern.
4. Fokus des Mikroskops unter Phasenkontrast, bis Sie die Zellen sehen können und dann zu fluoreszierenden Modus. Machen Sie Fotos von den Zellen unter Fluoreszenzlicht bei 1 min, 2 min und 3 min. Nehmen Sie ein einzelnes Bild der Zellen unter Phasenkontrast.

2. Making the positiven Test

1. Spot die folgenden Verbindungen in der Reihenfolge auf einem anderen Objektträger: 1 ul DAKO + 1 ul der 4-Muñana + 2 ul der LPS + 1 ul der TBS.
2. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2 bis 3.1.4.

3. Making the Positive Prüfung zusammen mit Neuraminidase-Hemmer Tamiflu

1. Spot die folgenden Verbindungen in der folgenden Reihenfolge auf einem anderen Objektträger: 1μL DAKO + 1μL von 4-Muñana + 2 ul der LPS + 1 ul von Tamiflu.
2. Tamiflu-Konzentrationen werden in 1x Tris vorbereiteten Kochsalzlösung pH 7,4; die endgültige Konzentration der Verbindungen in Kontakt mit den lebenden Zellen auf der kreisförmigen Glasplatte wird mit einem Verdünnungsfaktor von 5 haben.
3. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2 bis 3.1.4.

4. Die Bestimmung der Konzentration des Inhibitors benötigt, um 50% der Sialidase-Aktivität (IC ₅₀₎ Inhibit

1. Zur Quantifizierung der Fluoreszenz um die Zellen, werden die Bilder analysiert mittels ImageJ 1.38x mit der Analyse-Plugin für die Messung RBG. Nehmen Sie 50 stichprobenartige Messungen der Fluoreszenz die Zellen umgebenden und berechnet den Mittelwert der gesamten Fluoreszenz.
2. Die IC ₅₀ ist aus einem Grundstück von der Inhibitorkonzentration als log-Einheiten umgewandelt (zB log ng / mL) auf der x-Achse gegen die mittlere Fluoreszenz auf der y-Achse mittels nichtlinearer Regression erzeugt.

5. Secrets to Success

1. Sicherstellen, dass die Zellen in Kultur sind frei von Verunreinigungen von Mykoplasmen. Wir verwenden routinemäßig Plasmocin in einem Kulturmedium, um für dieses Steuerelement.
2. Die künstliche Neuraminidase Substrat, 4-Muñana, sollte verwendet werden frisch zubereitet werden. Die vorbereiteten Untergrund kann innerhalb einer Woche für die Sialidase Assay verwendet werden.
3. Wenn die Zelllinie hat einen niedrigen Rezeptor-Expression auf der Zelloberfläche, kann man eine höhere Dosis des Liganden für die Stimulation zu verwenden.
4. Wir haben auch erlebt, dass die Zellen über 6 mal passagiert könnte ihren Rezeptor Phänotyp verlieren. Frisch, sollte wiederbelebt Zellen kultiviert werden.

6. Repräsentative Ergebnisse

Siehe animierte Protokoll der Sialidase-Assay mit repräsentativen Ergebnissen in der beigefügten Powerpoint-Datei .

Mit dem neu entwickelten Assay Sialidase-Aktivität in lebenden Makrophagen ^{2 zu} erfassen, haben wir diese Technologie, um Sialidase-Aktivität in Liganden-induzierter Sialidase-Aktivität zu erkennen in Live-BMC-2 Makrophagen in einer dosisabhängigen Weise sowie in Live-DC-2.4 dendritischen Zellen , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 Mamma-Adenokarzinom-Zellen, menschliche WT und 1140F01 und WG0544 Typ I Sialidose Fibroblasten. Neuraminidase-Hemmer wie Tamiflu (Oseltamivir Phosphat) gehemmt thymoquinone-induzierte Sialidase-Aktivität in Live-BMC-2-Zellen mit einem IC ₅₀ von 0,0194 uM zu einer IC ₅₀ von 19,17 pM für Neuraminidase-Hemmer DANA (2-deoxy-2 ,3-Dehydro-Vergleich DN-Acetylneuraminsäure) ^5. Wir haben auch berichtet, dass andere Anwendungen wie spezifische anti-Neu1, -2 und 3-Antikörper keine Hemmung der TQ-induzierte Sialidase-Aktivität in Live-BMC-2 und der menschlichen THP-1 Makrophagen, aber anti-Neu4 Antikörper vollständig zu blockieren diese Tätigkeit. Es ist eine Anwendung der Sialidase-Aktivität zu einem kräftigen Sialidase-Aktivität mit TQ verbundenen erkennen behandelt Live primäre Knochenmark (BM) Makrophagen-Zellen aus WT-und hypomorphen Cathepsin A-Mäusen mit einem sekundären Neu1 Mangel (NeuI KD), aber nicht aus Neu4 Knockout abgeleitet ( Neu4 KO) Mäusen ^1,2,5. Darüber hinaus angewendet Pertussis-Toxin (PTX), ein spezifischer Inhibitor der Gαi Proteine ​​der G-Protein gekoppelten Rezeptor (GPCR) und das breite Spektrum Inhibitoren von Matrix-Metalloproteinase (MMP) galardin und Piperazin zu leben BMC-2, THP-1 und Grundschulen BM Makrophagen vollständig blockieren TQ-induzierte Sialidase-Aktivität ^5. Dieselben hemmende Effekte sind nicht mit der GM1-Gangliosid spezifischen Cholera-Toxin-Untereinheit B (CTXB) sowie mit CTX, Tyrosinkinase-Inhibitor K252a, und das breite Spektrum GPCR Inhibitor Suramin beobachtet. Die spezifischen Inhibitor der MMP-9, anti-MMP-9-Antikörper und anti-Neu4 Antikörper, nicht aber die spezifischen Inhibitor von MMP-3 vollständig zu blockieren TQ-induzierte Sialidase-Aktivität in Live-THP-1 Zellen, die Neu4 und MMP-9 Express auf dem Zelloberfläche ^5.

Zusammengenommen können die Sialidase Assay verwendet werden, um leistungsstarke Einblicke in die molekularen Mechanismen von Liganden-induzierte Rezeptor-Aktivierung mit Sialidasen wie Neu1 oder Neu4 abhängig von der Art des Liganden liefern. Die Schnelligkeit des Liganden-induzierter Sialidase-Aktivität durch den Liganden-gebundenen Rezeptor vermittelt legt nahe, dass glykosylierten Rezeptoren wie NGF TrkA, BDNF und TrkB Toll-like Rezeptoren eine Signalisierung Paradigma Form auf der Zelloberfläche Membran mit einer molekularen organisatorische Plattform von Ligand-Rezeptor gebunden , Gαi Proteine, MMP-9 und Neu1 oder Neu4 Sialidase. Ligandenbindung jeweiligen Rezeptoren führt Sialidase-Aktivität durch GPCR-Signalisierung über Membran Gαi Proteine ​​und MMP-9-Aktivierung. Neu1 oder Neu4 und MMP-9 cross-talk im Komplex mit dem Rezeptor auf der Zelloberfläche ermöglicht eine schnelle Aktivierung des Sialidase um Sialinsäure-sterische Hinderung an Rezeptor-Bindung zu entfernen bei der Erstellung eines funktionellen Rezeptor.