Rilevazione di attività NEU1 sialidasi nella regolamentazione Toll-like l'attivazione del recettore

1. Resuscitare i macrofagi congelati

1. Prima di risorgere cellule congelate dal freezer -80 ° C, si ha la necessità di preparare un terreno di coltura sterile filtrata utilizzando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 5 mg / mL di plasmocin. Plasmocin è una soluzione di antibiotico utilizzato nella nostra ricerca per eliminare e prevenire la contaminazione da micoplasma di colture cellulari.
2. Per un flaconcino di cellule congelate, si aggiunge 4 mL, 1 mL del mezzo di coltura per un CM 25 ² pallone di coltura cellulare in una cappa sterile contenimento rischio biologico.
3. Quando la fiala di cellule congelate sono prese dal congelatore ° -80 C, vengono scongelati rapidamente dal riscaldamento mano nella cappa sterile, che dura circa 2-3 minuti.
4. Non appena le cellule vengono scongelati, vengono rapidamente trasferiti nel pallone contenente il mezzo condizionato usando una pipetta sterile 1 ml.
5. Il pallone contenente le cellule si trovano in un tessuto culturale incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2.
6. Le cellule controllato per la crescita e l'adesione su base giornaliera fino a diventare il 75% al ​​90% confluenti utilizzando un microscopio invertito.
7. Durante l'incubazione di colture cellulari, 12 vetrini millimetri circolare vengono sterilizzati con copertura in etanolo al 70% in un grande piatto di vetro petri per 1 ora nel quadro di contenimento rischio biologico, l'alcol è poi rimosso e conservato per reusage, e le pareti di vetro bagnato sono lasciati esposti alla sterile filtrata flusso d'aria nel mobile sotto un UV per 24 ore o fino a quando sono asciutti.

2. Le cellule placcatura per il saggio sialidasi

1. Prima di placcatura le cellule, una singola scivolo sterile di vetro circolare viene accuratamente posizionato in un pozzetto di un Falcon 24-BD bene a fondo piatto con coperchio tessuto-cultura lastra di polistirene trattate utilizzando un sterilizzati curva fiammeggiante pieno, 4 ", seghettata, pinza in acciaio inox . Per un pallone di cellule al 75% confluenza, di solito utilizzare 12 pozzetti della piastra di coltura.
2. Per le cellule macrofagi aderenti, il medium DMEM condizionato viene rimosso dal pallone con una pipetta da 5 ml sterile nel quadro di contenimento sterile. Lavare le cellule aderenti, una volta con 1x sterile salina Tris tamponata pH 7,4 a rimuovere qualsiasi supporto contenente siero, e aggiungere 1 ml di calcio-media liberi (CMF) tampone fosfato a pH 7.4 sufficiente a coprire le cellule. Le cellule si trovano nel 37 ° C incubatore per circa 10 minuti o fino a quando le cellule iniziano a sollevare nel pallone. Il pallone può essere cullati o agitato al fine di allentare le rimanenti cellule aderenti.
3. Per il 1 ml di cellule sospese nel pallone, aggiungere 3 ml di medium DMEM condizionata. Prendere 0,5 mL di cellule sospese e sterilmente loro trasferite alla piastra di coltura di tessuto contenente le 12 lastre di vetro circolare mm. Circa, 0,5 x 10 ⁶ cellule vengono trasferite alle diapositive di vetro circolare.
4. La piastra di coltura delle cellule dei tessuti contenenti vengono incubate a 37 ° C in 5% di CO ₂ per 24 ore al fine di consentire alle cellule di aderire alle diapositive di vetro circolare.

3. Sialidasi Assay

1. Rendere il controllo

1. Posizionare un vetrino da microscopio (smerigliato: 1 fine, 1slide, 25 x 75 x 1 mm) nel quadro di contenimento o banco di laboratorio ed aggiungere mescolando in ordine sequenziale i seguenti composti: 1 ml DAKO + 1 ml di 4-MUNANA e infine + 3 ml di soluzione salina Tris tamponata pH 7.4 (TBS).
2. Dopo aver rimosso i mezzi di comunicazione da un pozzetto contenente le cellule, sollevare delicatamente il vetrino circolare di vetro con il "4 pinza verso l'angolo del pozzo. Rimuovere con cura il vetrino con la pinza e inserire il vetrino con le cellule si affaccia sulla soluzione miscela di il vetrino da microscopio.
3. Immediatamente, prendere lo scorrimento microcope ad un epi-microscopia a fluorescenza che è stato impostato per il filtro UV e ha una fotocamera digitale per catturare le immagini fluorescenti.
4. Messa a fuoco il microscopio in contrasto di fase fino a vedere le cellule e quindi passare alla modalità fluorescente. Scatta foto delle cellule sotto fluorescenti a 1 min, 2 min e 3 min. Prendete una singola immagine delle cellule in contrasto di fase.

2. Rendere il test positivo

1. Spot i seguenti composti in ordine sequenziale su un altro vetrino da microscopio: 1 ml DAKO + 1 ml di 4-MUNANA + 2 ml di LPS + 1 ml di TBS.
2. Ripetere i passi da 3.1.2 a 3.1.4 di cui sopra.

3. Rendere il test positivo con Tamiflu inibitore della neuraminidasi

1. Spot i seguenti composti nel seguente ordine sequenziale su un altro vetrino da microscopio: 1ml DAKO + 1ml di 4-MUNANA + 2 ml di LPS + 1 ml di Tamiflu.
2. Concentrazioni di Tamiflu sono pre-preparati in 1x salina Tris tamponata pH 7.4; la concentrazione finale dei composti in contatto con le cellule in diretta su vetrino circolare avrà un fattore di diluizione su 5.
3. Ripetere i passi da 3.1.2 a 3.1.4 di cui sopra.

4. Determinazione della concentrazione di inibitore necessaria per inibire il 50% delle attività sialidasi (IC ₅₀₎

1. Per quantificare il fluorescenti che circonda le cellule, le immagini vengono analizzati utilizzando ImageJ 1.38x con l'analizzare i plugin per la misurazione RBG. Prendere 50 letture casuali della fluorescenza che circonda le cellule e calcolare la media della fluorescenza totale.
2. L'IC ₅₀ è generato da un complotto della concentrazione di inibitore convertito in unità log (ad esempio, log ng / mL) su l'asse x contro la fluorescenza media sul l'asse y utilizzando la regressione lineare.

5. I segreti del successo

1. Assicurarsi che le cellule in cultura sono esenti da contaminazione da micoplasma. Noi abitualmente uso Plasmocin in un terreno di coltura per il controllo per questo.
2. Il substrato artificiale neuraminidasi, 4-MUNANA, devono essere utilizzati preparati al momento. Il substrato preparato può essere utilizzato entro una settimana per il test sialidasi.
3. Se la linea cellulare ha una bassa espressione dei recettori sulla superficie cellulare, si può usare una dose più alta del ligando per la stimolazione.
4. Abbiamo anche sperimentato che le cellule diversi passaggi per più di 6 volte potrebbero perdere il loro fenotipo recettore. Fresco, le cellule devono essere coltivate risorto.

6. Rappresentante Risultati

Vedi protocollo d'animazione del saggio sialidasi con risultati rappresentante nel allegato file di Powerpoint .

Utilizzando il test di nuova concezione per rilevare l'attività sialidasi in cellule vive macrofagi ^2, abbiamo utilizzato questa tecnologia per rilevare l'attività sialidasi in ligando indotta attività sialidasi in live BMC-2 cellule macrofagi in modo dose-dipendente e in live-2.4 DC cellule dendritiche , HEK-TLR4/MD2, HEK293, le cellule di adenocarcinoma mammario SP1, WT umana e 1140F01 e WG0544 tipo I fibroblasti sialidosi. Gli inibitori della neuraminidasi come il Tamiflu (oseltamivir fosfato) ha inibito Timochinone indotta attività sialidasi in diretta BMC-2 cellule con un ₅₀ di 0,0194 mM IC rispetto ad un IC ₅₀ di 19,17 mM per l'inibitore della neuraminidasi DANA (2-deossi-2 ,3-diidro- DN-acetilneuraminico acido) ^5. Abbiamo anche riferito che altre applicazioni, quali anticorpi specifici anti-NEU1, -2 e 3 non hanno alcuna inibizione di TQ-indotta attività sialidasi in diretta BMC-2 e umana THP-1 le cellule dei macrofagi, ma gli anticorpi anti-Neu4 bloccare completamente l'attività. C'è un'applicazione dell'attività sialidasi di rilevare una attività vigorosa sialidasi associata TQ trattati dal vivo del midollo osseo primario (BM), le cellule derivate da macrofagi catepsina WT e hypomorphic Un topi con un deficit secondario NEU1 (NeuI KD), ma non da Neu4 eliminazione diretta ( Neu4 KO) topi ^1,2,5. Inoltre, la tossina della pertosse (PTX), un inibitore specifico delle proteine ​​Gαi di G-proteina recettore accoppiato (GPCR) e gli inibitori vasta gamma di metalloproteinasi della matrice (MMP) galardin e piperazina applicata a vivere BMC-2, THP-1 e primaria macrofagi BM bloccare completamente TQ-indotta attività sialidasi ^5. Questi stessi effetti inibitori non vengono osservate con i gangliosidi GM1 specifiche subunità B della tossina colerica (CTXB) così come con CTX, inibitore della tirosin-chinasi K252a, e l'ampia gamma di GPCR inibitore suramina. L'inibitore specifico della MMP-9, anti-MMP-9 e di anticorpi anti-Neu4 anticorpi ma non l'inibitore specifico della MMP-3 bloccare completamente TQ-indotta attività sialidasi in live THP-1 le cellule che esprimono Neu4 e MMP-9 sul superficie cellulare ^5.

Nel loro insieme, il test sialidasi può essere usato per fornire spunti potente per i meccanismi molecolari del ligando indotta da attivazione del recettore coinvolge sialidasi come NEU1 o Neu4 a seconda della natura del legante. La rapidità del ligando indotta attività sialidasi mediato dal recettore ligando legato suggerisce che i recettori TrkA glicosilato come NGF, BDNF TrkB e recettori Toll-like formare un paradigma di segnalazione sulla superficie della membrana cellulare che coinvolge una piattaforma molecolare organizzativa del ligando-recettore legato , proteine ​​Gαi, MMP-9 e NEU1 o Neu4 sialidasi. Ligando vincolante rispettivi recettori induce l'attività sialidasi attraverso GPCR di segnalazione tramite proteine ​​di membrana Gαi e MMP-9 di attivazione. NEU1 o Neu4 e MMP-9 cross-talk in complesso con il recettore sulla superficie delle cellule permette una rapida attivazione della sialidasi di rimuovere l'acido sialico, impedimento sterico per associazione recettore nel generare un recettore funzionale.