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 JoVE Bioengineering

कंट्रास्ट अल्ट्रासाउंड औषधि असर nanoparticle वितरण और Microvascular एबलेशन के माध्यम से चूहे में Gliomas के उपचार लक्षित

1, 1,2

1Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 2Neurological Surgery , University of Virginia

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Cite this Article: कंट्रास्ट अल्ट्रासाउंड औषधि असर nanoparticle वितरण और Microvascular एबलेशन के माध्यम से चूहे में Gliomas के उपचार लक्षित

Burke, C. W., Price, R. J. Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation. J. Vis. Exp. (46), e2145, doi:10.3791/2145 (2010).

Abstract: कंट्रास्ट अल्ट्रासाउंड औषधि असर nanoparticle वितरण और Microvascular एबलेशन के माध्यम से चूहे में Gliomas के उपचार लक्षित

हम न्यूनतम इनवेसिव विपरीत एजेंट microbubble आधारित चिकित्सकीय दृष्टिकोण जिसमें permeabilization और / या microvasculature की पृथक अल्ट्रासाउंड स्पंदन मापदंडों अलग द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं विकसित कर रहे हैं. विशेष रूप से, हम परीक्षण कर रहे हैं कि क्या इस तरह के तरीकों के लिए दवा वितरण और microvascular पृथक के माध्यम से घातक मस्तिष्क ट्यूमर के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रारंभिक अध्ययन के लिए तय है कि लक्षित nanoparticle दवा असर डिलीवरी 100nm (Lactide - सह - glycolide) पाली (PLAGA) नैनोकणों कि albumin खोलीदार microbubbles के लिए पालन कर रहे हैं शामिल अल्ट्रासाउंड मध्यस्थता विनाश "समग्र" वितरण एजेंटों के द्वारा मदद की जा सकती प्रदर्शन किया गया है . हम microbubble-nanoparticle समग्र एजेंट (MNCAs) के रूप में इन एजेंटों निरूपित. जब अल्ट्रासाउंड के साथ उपचर्म C6 gliomas के लिए लक्षित है, हम MNCA इलाज ट्यूमर में एक तत्काल 4.6 गुना nanoparticle वितरण में नैनोकणों और 8.5 गैर इलाज ट्यूमर से अधिक गुना वृद्धि के साथ सह प्रशासित microbubbles के साथ इलाज ट्यूमर से अधिक वृद्धि मनाया. इसके अलावा, कई कैंसर अनुप्रयोगों में, हमें विश्वास है कि यह ट्यूमर microcirculation, जो ट्यूमर hypoxia और apoptosis के लिए नेतृत्व करेंगे के पृथक के साथ संयोजन के रूप में लक्षित दवा वितरण करने के लिए वांछनीय हो सकता है. यह अंत करने के लिए, हम गैर theramal cavitation प्रेरित microvascular पृथक की प्रभावकारिता का परीक्षण किया है, दिखा रहा है कि इस दृष्टिकोण ट्यूमर छिड़काव में कमी, apoptosis, महत्वपूर्ण वृद्धि निषेध, और परिगलन elicits. साथ में ले ली, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि हमारे दृष्टिकोण अल्ट्रासाउंड लक्षित microvascular और पृथक / के माध्यम से ट्यूमर परिगलन बनाने या एक साथ gliomas में दवा पेलोड को बढ़ाने के द्वारा चिकित्सकीय दक्षता बढ़ाने की क्षमता है.

Protocol: कंट्रास्ट अल्ट्रासाउंड औषधि असर nanoparticle वितरण और Microvascular एबलेशन के माध्यम से चूहे में Gliomas के उपचार लक्षित

1. Microbubble उत्पादन

  1. Albumin microbubbles (एमबीएस) तैयार करने के लिए, सामान्य नमक में एक फ्लास्क में गैस की एक जलकृत चरण ऊपर (octafluoropropane) कंबल के साथ सीरम albumin के एक 1% समाधान जगह. संक्षेप में एक अल्ट्रासाउंड के साथ एक आधा "टाइटेनियम जांच विस्तारित सुसज्जित फाड़नेवाला के साथ समाधान (30 सेकंड) sonicate इस निर्माण (जीई Heathcare) Optison है, जो 0.5-1.2 x 9 10 एमबीएस / एमएल के एक एकाग्रता की रेंज में उपलब्ध कराया जाता है के लिए इसी तरह की है. एक Multisizer कल्टर काउंटर के साथ एमबी व्यास मतलब का निर्धारण करते हैं. albumin मतलब एमबी व्यास इस अध्ययन में इस्तेमाल 1.93um था ± 1.63um.
  2. लिपिड एमबीएस बनाना, 1 मिलीग्राम / एमएल polyethyleneglycol 40 stearate (सिग्मा रासायनिक कं, सेंट लुइस, MO) और 2 मिलीग्राम / एमएल distearoyl phosphatidylcholine (अवंती ध्रुवीय Lipids, सिलखड़ी, अल) के एक जलीय फैलाव को तैयार है और के रूप में पहले sonciate decafluorobutane गैस के साथ वर्णित (1.1). एक Multisizer कल्टर काउंटर के साथ एमबी व्यास मतलब का निर्धारण करते हैं. इस अध्ययन में प्रयोग किया जाता मतलब लिपिड एमबी व्यास 2.01um ± 1.29um था.

2. Nanoparticle निर्माण

  1. इन तरीकों से अनुकूलित किया गया पानी तेल पानी में पायस विलायक वाष्पीकरण तकनीक Davda (2002) और चैपल (2008) द्वारा वर्णित है.
  2. विआयनीकृत जल (डि) के 1000 मिलीलीटर में PVA के 20g भंग करके एक 2% पोलीफोनिक (vinyl शराब) PVA समाधान तैयार करें. समाधान पूरी तरह से हलचल थाली पर रातोंरात भंग करने की अनुमति दें. एक 0.22μm बाँझ फिल्टर के साथ 10 मिनट और फिल्टर के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र समाधान निकालने के लिए किसी भी अवशिष्ट undissolved PVA.
  3. गोजातीय सीरम albumin (BSA) लोड पाली (लैक्टिक - सह glycolic एसिड) (PLAGA) नैनोकणों (एनपीएस) बनाना, 6ml methylene क्लोराइड (एमसी) में एक गिलास जगमगाहट शीशी में uncapped 85:15 PLAGA के 180mg भंग. भंवर / एम सी PLAGA 2 मिनट के लिए समाधान.
  4. पीबीएस के 1.5 मिलीलीटर में वांछित पेलोड (BSA के 15mg) भंग. दो भागों में आंतरायिक vortexing साथ समाधान / PLAGA एमसी पीबीएस / BSA समाधान जोड़ें. 5minutes के लिए बर्फ पर प्लेस समाधान और 120 सेकंड के लिए 45W पर sonicate.
  5. एम सी / PLAGA / / पेलोड 24ml 2% PVA पीबीएस समाधान मध्यवर्ती vortexing के साथ दो भागों में जोड़ें.
  6. बर्फ पर 5minutes के लिए समाधान और रखकर 120 के लिए 45W पर sonicate.
  7. एम सी और एनपी स्थिरीकरण के वाष्पीकरण की अनुमति एक धूआं हुड में एक हलचल प्लेट पर 12 घंटे के लिए एनपी पायस हिलाओ.
  8. 4 में 25minutes के लिए 20,000 rpm पर निलंबन अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस दो बार एनपीएस को अलग करने के लिए और अवशिष्ट PVA हटायें. 1000 RMP से कम 10 मिनट के लिए डि पानी और अपकेंद्रित्र के 8ml में गोली 4 ° Resuspend सी एनपीएस की 100nm आबादी को अलग करने के लिए.
  9. पृथक सतह पर तैरनेवाला और फ्लैश -80 पर स्थिर डिग्री सेल्सियस 48 घंटे के लिए जमे हुए नमूना Lyophilize. Dessicator में lyophilized कणों -80 ° उपयोग के समय जब तक सी स्टोर.

3. समग्र डिलिवरी वाहन निर्माण (प्रोटोकॉल VisEn रसायन विज्ञान नोट्स से रूपांतरित)

  1. VivoTag680 carboxy सतह कार्यक्षमता के लिए रूपांतरण
    1. 1.0 एम HEPES, 7 पीएच और 25 μL DMSO में Succinic एनहाइड्राइड (2.5 मिलीग्राम, 25 ìmol) का 50 μL के साथ VivoTag680 की एक शीशी का मिश्रण. इस समाधान, अच्छी तरह से मिश्रित करने के लिए 1.0 एम NaOH के 50 μL जोड़ें, समाधान 2 घंटे के लिए कमरा प्रकाश से सुरक्षित तापमान पर प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देते हैं. जैव रेड (P100, मध्यम) BioGel 0.1 एम एमईएस बफर, पीएच 6.0 के साथ eluting का उपयोग कणों शुद्ध. हरी बैंड लीजिए.
  2. VivoTag680 carboxy संशोधित सक्रियकरण
    1. Carboxy संशोधित 0.1 एम एमईएस बफर, पीएच 6 में प्राप्त VivoTag680 के 1 मिलीग्राम 1-एथिल-3 (3 - dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) और एन hydroxysulfosuccinimide (Sulfo एनएचएस) के 2.2 मिलीग्राम के साथ गठबंधन. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें.
    2. जेल निस्पंदन द्वारा सक्रिय जैव रेड (P100, मध्यम) BioGel 0.1 एम एमईएस बफर, 6.0 पीएच साथ eluting का उपयोग कर अधिक सक्रिय एजेंट (EDC) के कणों से शुद्ध और हरी बैंड इकट्ठा. Amine युक्त अणु (जैसे BSA लोड Nanoparticle) के लिए तुरंत सक्रिय कणों संयुग्म. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए समाधान की अनुमति दें. अमाइन संयुग्मित एनपीएस अधिक EDC से 4 ° C में 60min के लिए 20,000 rpm पर centrifuging centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला डालने के लिये और 0.1 एमईएस बफर में resuspending द्वारा शुद्ध किया गया.
  3. यहाँ बंद करो दवा वितरण के अध्ययन के लिए VivoTag680 टैग एनपीएस बनाना.
  4. Carboxy संशोधित PLGA-BSA - VivoTag680 नैनोकणों (NP680) के albumin microbubbles के लिए संयुग्मन
    1. NP680 के 1 मिलीग्राम 1-एथिल-3 (3 dimethylaminopropyl) (EDC) carbodiimide और N-hydroxy sulfosuccinimide (Sulfo एनएचएस) के 2.2 मिलीग्राम के साथ 0.1 एम एमईएस बफर, पीएच 6 में प्राप्त मिश्रण. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के समाधान के लिए प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें.
    2. 60min के लिए 20,000 rpm पर 4 ° centrifuging सी, centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला डालने का कार्य के द्वारा शुद्ध अतिरिक्त EDC से सक्रिय नैनोकणों. Resuspend 0.1 एमईएस बफर में नैनोकणों.
    3. Albumin एमबीएस समाधान से अधिक BSA निकालने degassed पीबीएस में तीन बार धोएं.
    4. Amine युक्त अणुओं (उदाहरण के लिए albumin microbubbles) के लिए तुरंत सक्रिय कणों संयुग्म. NP680 समाधान 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति दें. अनबाउंड NP680s से degassed पीबीएस के साथ तीन बार धोने से NP680 संयुग्मित microbubbles (MNCA) शुद्ध.
    5. कल्टर काउंटर का उपयोग MNCAs की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.

4. ट्यूमर मॉडल

सभी पशु प्रयोगों में एक जानवर के वर्जीनिया पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ अनुपालन में थे.

  1. C6 Giloma चूहे ट्यूमर कोशिका लाइन यूवीए के डॉ. जेसन Sheehan (Charlottesville, VA) द्वारा प्रदान की गई थी.
    1. कक्ष लाइन कोशिकाओं mycoplasma मुक्त करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया गया था.
  2. एफ 12K पोषक तत्व के साथ 16% के घोड़े सीरम, 3% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और एक पेन Strep 37% (Gibco, संयुक्त राज्य अमरीका) डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. पूरक मिश्रण में सेल लाइन रखें
  3. 3 एक्स 10 6 C6 Giloma ट्यूमर पीबीएस के 300 μl में छोड़ दिया hindlimb में निलंबित subcutaneously कोशिकाओं के साथ C57BLJ6/Rag1 चूहों (जैक्सन) का टीका लगाना. ट्यूमर के लिए 12 दिनों के लिए विकसित करने के लिए 8-10mm की एक अधिकतम व्यास तक पहुँचने की अनुमति दें.

5. Vivo अल्ट्रासाउंड अनुप्रयोग में

  1. एक intraperitoneal (आईपी) ketamine हाइड्रोक्लोराइड (60 शरीर के वजन मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (0.1 शरीर के वजन मिलीग्राम / किग्रा) के संयोजन के इलाज के लिए पहले इंजेक्शन के साथ चूहों anesthetize.
  2. Ketamine हाइड्रोक्लोराइड रखरखाव संवेदनाहारी (20 शरीर के वजन मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (0.3 शरीर के वजन मिलीग्राम / किग्रा) तैयार करें. प्रशासन के रूप में की जरूरत है.
  3. एमबी एमबी / एनपी या MNCA समाधान की नसों में प्रशासन (चतुर्थ) के लिए प्रत्येक जानवर की पूंछ नस Cannulate.
  4. ट्यूमर छिड़काव माप
    1. चतुर्थ एक निरंतर प्रेरणा पंप (, हार्वर्ड उपकरण, Holliston, एमए हार्वर्ड उपकरण पीएचडी 2000) के साथ एक लिपिड एमबी (1x10 8 एमबीएस / 0.9% खारा की 0.3 मिलीलीटर में जी शरीर के वजन) समाधान 15μl/min की दर पर दिखे .
    2. एक Sequoia Acuson 512 अल्ट्रासोनोग्राफी (सीमेंस चिकित्सा समाधान, माउंटेन व्यू, सीए) प्रणाली के साथ एक 8 13 मेगाहर्ट्ज रैखिक 15L8 जांच सुसज्जित इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था विपरीत बढ़ाया ट्यूमर छिड़काव यों. युगल पानी आधारित एक अल्ट्रासाउंड जेल (पार्कर, प्रयोगशालाओं, Inc, Fairfield, NJ पार्कर प्रयोगशालाओं Aquasonic 100) के साथ ट्यूमर 15L8 जांच. बी मोड में ट्यूमर स्कैन के लिए सबसे अच्छा इमेजिंग विमान प्राप्त है.
    3. इसके विपरीत नाड़ी अनुक्रम मोड (सीपीएस) में, एक सतत microbubbles संकेत तीव्रता कैप्चरिंग 5 सेकंड पहले वीडियो, और निम्नलिखित 20, 13Hz की एक फ्रेम दर पर उच्च आयाम "फट" पल्स हासिल. चार इमेजिंग विमानों में माप दोहराएँ.
    4. दस मिनट रुको albumin एमबीएस पानी में डालना और चिकित्सीय कम आवृत्ति उपचार आरंभ करने के लिए लिपिड एमबीएस प्रचलन से स्पष्ट करने के लिए अनुमति देते हैं.
  5. चिकित्सीय अल्ट्रासाउंड उपचार
    1. पार्श्व ट्यूमर ऊपर त्वचा, ट्यूमर छिड़काव जोड़े (5.3) 0.75''व्यास 1 मेगाहर्ट्ज अनफोकस्ड transducer (Panametrics, वॉल्थम, एमए A314S) माप के बाद दस मिनट. चतुर्थ एक albumin एमबी (1 x10 5 ग्राम / शरीर के वजन के 0.9% खारा की 0.3 मिलीलीटर में एमबीएस), एमबी / एनपी (1 x10 5 एमबीएस / छ और 0.2 स्नातकीय एनपीएस ग्राम / शरीर के वजन के 0.9% की 0.3 मिलीलीटर में खारा) या पानी में डालना MNCA समाधान (1 x10 5 MNCAs / छ 0.9% खारा की 0.3 मिलीलीटर में शरीर के वजन).
    2. दवा वितरण उपचार
      1. "एक फट" एनपीएस, एमबीएस और एनपीएस के सह इंजेक्शन, या MNCAs (5.4.1) के एक निरंतर प्रेरणा के दौरान पल्स अनुक्रम (5.4.2.2) के साथ साठ मिनट के लिए Insonate.
      2. "1-फट" स्पंदन अनुक्रम 100 लगातार मेगाहर्ट्ज 1 sinusoids (कर्तव्य चक्र = 0.००,००२) एक तरंग जनरेटर से 1V चोटी के आयाम के लिए पीक प्रत्येक (; Tektronix इंक, Beaverton, या AFG-310) के होते हैं. एक शक्ति एम्पलीफायर के साथ एक 55 डीबी आरएफ (; इलेक्ट्रॉनिक नेविगेशन इंडस्ट्रीज, रिचर्डसन, TX ENI 3100LA) द्वारा तरंग संकेत बढ़ाना.
    3. पंचमी विभक्ति उपचार
      1. 5.4.2.1 करने के लिए समान है, लेकिन "5 फट - मध्यम" या "5 फट - विस्तारित" के साथ insonate स्पंदन अनुक्रम
      2. "5 - फट मध्यम" स्पंदन अनुक्रम 5000 1 मेगाहर्ट्ज (कर्तव्य चक्र = .005) sinusoids 1V आयाम करने के लिए पीक चोटी के प्रत्येक के होते हैं. "5 फट - Exteneded" स्पंदन अनुक्रम दस हज़ार 1 मेगाहर्ट्ज (कर्तव्य चक्र = 0.01) sinusoids 1V आयाम करने के लिए पीक चोटी के प्रत्येक के होते हैं.
      3. एक सुई thermocouple (ओमेगा टी प्रकार, HYP1-30-1/2-TG-60-SMPW-M) जांच ट्यूमर में 2cm डालने के द्वारा प्रयोग मॉनिटर ट्यूमर तापमान के समय के दौरान. रिकार्ड तापमान माप हर पांच मिनट.
  6. ट्यूमर छिड़काव के रूप में चिकित्सीय उपचार के बाद 5.3 दस मिनट में वर्णित माप दोहराएँ.

6. ट्यूमर छिड़काव मात्रा

  1. Sequoia पर सीपीएस कार्यक्रम का उपयोग करना, acq मोड में प्रवेश. वें का चयन करेंई पूरा ट्यूमर की मात्रा शामिल हित के क्षेत्र. छिड़काव वसूली घटता फार्म के उत्पन्न हो जाएगा y = एक (1 - ए - βt) + (2002 Sadlowski; Chromas 2001, ये 2004) सी कि सीपीएस डेटा के लिए फिट हैं. Β, लाल रक्त कोशिका वेग, पूर्व उपचार और उपचार के बाद के एक रिश्तेदार को मापने का मूल्यांकन.
  2. बंद लाइन विश्लेषण के लिए निर्यात सीपीएस फ़ाइलें. AVI फ़ाइलें में डेटा कनवर्ट करें. फ्रेम दर फ्रेम छवि दृश्यों में AVI फ़ाइलें तोड़ो. कॉम्पैक दृश्य Fortan, या इसी तरह के सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करना, एक समय उत्पन्न विनाशकारी नाड़ी से सभी तख्ते की छवि औसत विनाशकारी नाड़ी के बाद 8 सेकंड के लिए.
  3. Perfused ट्यूमर क्षेत्र निर्धारित, ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए, 8 काटने समय सीपीएस छवि औसत 247 की एक सीमा लागू करते हैं और मात्रा ट्यूमर के भीतर प्रतिशत बढ़ाया पिक्सल यों. समय के साथ बी मोड की इसी छवि ओवरले औसत thresholded छवि को सही रूप से ट्यूमर के क्षेत्र को परिभाषित.
  4. औसत प्रतिशत चार सीपीएस क्लिप की एक न्यूनतम के लिए क्षेत्र perfused के लिए एक विशेष रूप से ट्यूमर के लिए एक दिया समय बिंदु पर अंतिम perfused क्षेत्र प्राप्त करने के लिए.
  5. प्रतिशत perfused क्षेत्र (6.4) और (0.1) β रिश्तेदार ट्यूमर रक्त के प्रवाह को निर्धारित करने के उत्पाद ले लो.

7. ट्यूमर में biodistribution nanoparticle

  1. पहले एक कम alfasprot आहार (Harlan, इंडियानापोलिस में) पर fluorescently लेबल एनपीएस जगह चूहों के साथ इलाज के लिए बारह दिनों autofluorescence सामान्य माउस इमेजिंग जब चाउ की वजह से कम करने के लिए.
  2. दाढ़ी इमेजिंग साइट (जिगर के लिए पार्श्व) के लिए सभी बालों को हटाने के लिए.
  3. नायर के रूप में एक रासायनिक बालों को हटाने के एजेंट, के साथ अवशिष्ट बाल निकालें.
    1. सभी अवशिष्ट रासायनिक बाल हटानेवाला के कुल्ला या एक रासायनिक जला होने पर हो सकती है.
  4. और 5.4.2 में वर्णित उपचार के बाद उपचार 0, 1, 4, और 24 घंटे पहले FMT प्रणाली (VisEn मेडिकल) पर छवि चूहों.
  5. पहले इमेजिंग ketamine हाइड्रोक्लोराइड (60 शरीर के वजन मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (0.1 शरीर के वजन मिलीग्राम / किग्रा) के एक आईपी संयोजन इंजेक्शन के साथ anesthetize चूहों. इमेजिंग कारतूस पर प्लेस माउस. सफेद रोशनी और फ्लोरोसेंट मोड में reflectance छवियों मोल. बाहर VT680 चैनल में फ्लोरोसेंट tomographic इमेजिंग कैर्री.
  6. FMT इमेजिंग डेटा का उपयोग एक सामान्यीकृत जन्मे समीकरण के 3D पुनर्निर्माण उत्पन्न सॉफ्टवेयर रोजगार. पुनर्निर्माण के बाद, सभी तीन इमेजिंग विमानों (एक्स, वाई, जेड) में ब्याज की एक क्षेत्र (आरओआई) ड्राइंग द्वारा ब्याज की मात्रा (voi) का चयन करें. Voi है पैरों और जिगर को शामिल करने के लिए एक मतलब मूल्य फ्लोरोसेंट और कुल voi मात्रा और fluorochrome एकाग्रता, fluorescently टैग BSA एनपीएस के कारण उत्पन्न हो जाएगा.

8. ट्यूमर के विकास दर

  1. दैनिक डिजिटल calibers माप का उपयोग कर लेने के द्वारा ट्यूमर मात्रा का मूल्यांकन. ट्यूमर एक दीर्घवृत्ताभ सन्निकटन का उपयोग मात्रा की गणना, वी = 1 / 6 π एबीसी. जहां क, ख और ग तीन orthogonal विमानों में मापा ट्यूमर की अधिकतम व्यास हैं.

9. ट्यूमर प्रसंस्करण और विश्लेषण

  1. निम्नलिखित उपचार euthanize जानवरों सात दिनों. 2% की 10ml के साथ बाएं वेंट्रिकल और रक्तहीन करना रक्त Cannulate Heparinized Tris CaCl 2 (0.68 मिमी) बफर छिड़काव, 10ml Tris CaCl 2 (0.68 मिमी) बफर, 100 mmHg में 10 मिनट के लिए प्रत्येक के बाद.
  2. 100 mmHg में 10minutes के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde (4 डिग्री सेल्सियस) के एक जलसेक के साथ छिड़काव तय ऊतक. नमूना 60 मिनट के लिए तय करने के लिए अनुमति दें.
  3. आबकारी नमूनों, आयल में एम्बेड करते हैं, और 5 माइक्रोन वर्गों में कटौती.
  4. मानक धुंधला hematoxylin - eosin प्रदर्शन histological परिवर्तन है कि अल्ट्रासाउंड जोखिम के एक परिणाम के रूप में हुई हो सकती है है मूल्यांकन.
  5. Apoptotic कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, एक टर्मिनल deoxynucleotidyl transferase मध्यस्थता deoxyuridine triphosphate निक अंत (TUNEL के) लेबलिंग परख (ApoptTag किट, Intergen कं, Norcross, GA, संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग करें.

10. प्रतिनिधि परिणाम

1. Nanoparticle निर्माण (2.0)

  1. एनपीएस यदि इस प्रोटोकॉल ठीक से preformed है आकार में गोलाकार हो सकता है, के रूप में स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन microcopy (SEM) द्वारा निर्धारित होगा, और 100nm के चारों ओर एक गाऊसी वितरण किया है, के रूप में प्रकाश बिखरने तकनीक द्वारा निर्धारित है. प्रतिनिधि परिणाम चित्र 1 में दिखाया जाता है.

2. लक्षित दवा वितरण (5.4.1)

  1. हमारे (2002 गीत, चैपल 2008) प्रयोगशाला और अप्रकाशित चित्रा 2, intravascular नैनोकणों बढ़ाया वितरण में ट्यूमर ऊतक के लिए अल्ट्रासोनिक microbubble विनाश परिणाम में उपस्थित परिणाम में प्रदर्शन प्रकाशित अध्ययन के आधार पर. हम यह भी पता चला है कि हमारे MNCA बढ़ nanoparticle वितरण में प्रसव तकनीक परिणाम तुरंत उपचार के बाद.

3. ट्यूमर एबलेशन (5.4.3)

  1. हम से पता चला है कि अपेक्षाकृत कम कर्तव्य चक्र पर लंबे समय तक अल्ट्रासोनिक microbubble विनाश, (0.005-.01), यांत्रिक पृथक में परिणामट्यूमर और ट्यूमर के विकास के microvasculature प्रतिगमन. यदि यह प्रोटोकॉल ठीक से किया जाता है एक में परिवर्तन (i) के ट्यूमर के विकास की दर (चित्रा 3) की उम्मीद करनी चाहिए, (ii) ट्यूमर hemodynamics (चित्रा 4), (iii) परिगलित क्षेत्र, और apoptosis (iv).

चित्रा 1
PLAGA के चित्रा 1. विशेषता BSA असर नैनोकणों. (ए) ठीक गढ़े नैनोकणों के SEM छवि. (ख) अनुचित तरीके से गढ़े नैनोकणों के SEM छवि.

चित्रा 2
चित्रा 2 (ए) प्रतिदीप्ति की मध्यस्थता (FMT) (ऊपर) इलाज अल्ट्रासाउंड का टोमोग्राफी छवियों और (नीचे) इलाज चमड़े के नीचे तुरंत एक MNCAs, जहां नैनोकणों (एनपीएस) 680 प्रतिदीप्ति संकेत असर कर रहे हैं के साथ इलाज के बाद gliomas नियंत्रण पर आरोपित कर रहे हैं planar ग्रेस्केल उत्तेजना प्रकाश छवि.

चित्रा 3
चित्रा 3 प्रतिनिधि ट्यूमर के विकास में गुना पांच फट बढ़ाया स्पंदन प्रोटोकॉल के साथ microbubble insonation निम्नलिखित परिवर्तन .

चित्रा 4
चित्रा 4 (ए, सी बी) मोड और विपरीत बढ़ाकर (बी, डी) अल्ट्रासोनोग्राफी एक माउस में एक चमड़े के नीचे C6 glioma ट्यूमर की छवियों. प्रारंभिक pretreatment छवि में (ए) ज्यादातर hypoechoic ट्यूमर की सीमा नीले रंग में पता लगाया गया है. एक विपरीत एजेंट के अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद समय औसत वृद्धि (बी) pretreatment में दिखाया गया है. Posttreatment, इसके विपरीत इंजेक्शन से पहले, ट्यूमर फिर ज्यादातर hypoechoic (डी). इसके विपरीत इंजेक्शन के बाद, वहाँ ट्यूमर में काफी कम वृद्धि है.

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Discussion: कंट्रास्ट अल्ट्रासाउंड औषधि असर nanoparticle वितरण और Microvascular एबलेशन के माध्यम से चूहे में Gliomas के उपचार लक्षित

गंभीर कदम

माउस पूंछ नस Cannulation:

माउस पूंछ नस में अंतःशिरा इंजेक्शन एक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया किया जा सकता है. हालांकि, एक पूंछ नस कैथेटर बहुत एक सफल इंजेक्शन की संभावना में सुधार कर सकते हैं. कैथेटर बनाने के लिए, बार - बार आगे और पीछे एक 25 गेज सुई मोड़ जब तक यह हब से टूट जाता है. पीई 20 टयूबिंग के अंत में कुंद अंत डालें और सिलिकॉन गोंद के साथ कनेक्शन सील. Cannulation लिए कैथेटर तैयार करने के लिए, एक लोड के साथ 1% Cather के लिए खारा heparinized सिरिंज देते हैं और कैथेटर की मृत अंतरिक्ष में तरल पानी में डालना. अपने पक्ष पर एक anesthetized माउस स्थिति है तो पार्श्व पूंछ नस दृश्य में है. गर्म पानी (- 110 ° F 105 °) के साथ पूंछ को चौड़ा करना नस में सुई डालें. यदि सफल रक्त आमतौर पर कैथेटर प्रवेश करेंगे. सत्यापित करें कि सुई खारा की एक छोटी राशि के साथ नस समाशोधन द्वारा नस में है. जलसेक पंप करने के लिए सिरिंज संलग्न से पहले टेप के साथ जगह में कैथेटर को सुरक्षित करो.

Nanoparticle Resuspension:

नैनोकणों कुल निम्नलिखित lyophilization सकता है. पीबीएस में Resuspend कण, एक ध्वनि पानी के स्नान में बार - बार भंवर और sonicate संक्षिप्त (10 सेकंड). यह ठीक lyophilized नमूना resuspend महत्वपूर्ण है. SEM माइक्रोस्कोपी और lyophilization और resuspension निम्नलिखित प्रकाश बिखरने तकनीक के साथ निलंबन विशेषताएँ.

संभावित संशोधन:

Nanoparticle निर्माण प्रोटोकॉल समायोजन के मामले में, BSA एक किराए की दवा के रूप में कार्य करता है और चिकित्सीय एजेंटों के एक भीड़ के लिए interchanged हो सकता है. चिकित्सीय एजेंट की विलेयता पर निर्भर करता है, नैनोकणों एक तेल में पानी पायसन के रूप में या एक तेल में पानी में तेल पायसन के रूप में गढ़े जा सकता है. लोड हो रहा है और PLAGA एनपीएस से चिकित्सीय एजेंट के रिलीज दक्षता भी काफी समायोजित किया जा सकता है अगर वांछित. लोड हो रहा है दक्षता बढ़ाने के लिए, बहुलक वाहकों में एनपी निर्माण मानकों के अनुकूलन के माध्यम से दवा की लोडिंग / wt wt वृद्धि हुई है. चिकित्सीय एजेंट की रिहाई की दर दर्जी करने के लिए, hydrolysis दर आणविक वजन में परिवर्तन और / लैक्टिक glycolic PLAGA के अनुपात के माध्यम से निरंतर बदलती हैं. दोनों में और PLAGA एनपीएस से लोड हो रहा है दक्षता और चिकित्सीय एजेंट की रिहाई की दर, talioring करके, इच्छित स्थानीय एकाग्रता के ऊतकों को दिया जा सकता है. प्रसव के प्रोटोकॉल के समायोजन के मामले में, सबसे महत्वपूर्ण कारकों में अल्ट्रासोनिक MNCA विनाश और microvascular permeabilization की डिग्री कर रहे हैं. यह बताया गया है कि albumin खोलीदार microbubbles 1.3 के आधे जीवन ± 0.69 मिनट (± एसडी मतलब) (2008 Optison) है. हम परिकल्पना है कि निरंतर एजेंट जलसेक और लंबे समय तक अल्ट्रासाउंड आवेदन microvessel permeabilization की सीमा में वृद्धि होगी. बढ़ती उपचार समय तक हम transiently microvasculature के permeabilization बढ़ उद्देश्य.

गैर थर्मल यांत्रिक पृथक प्रोटोकॉल एमबी एकाग्रता या अल्ट्रासाउंड चोटी दबाव बदलने से समायोजित किया जा सकता है. यह उम्मीद है कि एमबी एकाग्रता और / या अल्ट्रासाउंड चोटी दबाव बढ़ाने ट्यूमर vasculature को नुकसान की डिग्री की वृद्धि होगी.

अनुप्रयोग:

हम ध्वनिक transcranial उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड (HIFU) द्वारा अपेक्षित वांछित उपचारात्मक प्रभाव तक पहुँचने की शक्ति को कम करने के लिए तकनीक विकसित कर रहे हैं.

भाग में, खोपड़ी और उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड (HIFU) अभी तक मस्तिष्क कैंसर के लिए एक चिकित्सीय विकल्प के रूप में बड़े पैमाने पर उपयोग नहीं हासिल किया है के साथ ऊतक, थर्मल ट्यूमर ऊतक पृथक आसपास के महत्व के माध्यम से उपचार के साथ जुड़े जटिलताओं की वजह से. एक नैदानिक ​​ट्रेन के पहले तीन रोगियों से प्रारंभिक निष्कर्ष उप - पंचमी विभक्ति कपाल हीटिंग में फोकल तापमान परिणाम (2009 McDannold) पर गहरी मस्तिष्क HIFU उपचार संकेत दिया है. HIFU के मस्तिष्क ट्यूमर के transcranial इलाज के लिए एक नैदानिक ​​उपचार के रूप में सफलता की कुंजी एक अच्छी तरह चित्रित क्षेत्र के लिए ध्वनिक ऊर्जा की डिलीवरी स्थानीयकरण क्षमता है. ध्वनिक ऊर्जा देने की क्षमता खोपड़ी और पिछले शल्य चिकित्सा resections जैसे हड्डी या हवा इंटरफेस है, जो चरण और शक्ति aberrations उत्पन्न अल्ट्रासाउंड ऊर्जा के रूप में प्रसार पथ (1998 Tanter) के साथ तनु है द्वारा जटिल है. इन aberrations अक्सर पूर्व - फोकल (2009 McDonnald) हीटिंग और स्वस्थ ऊतकों में cavitations योगदान करते हैं.

पिछले कई वर्षों से, लक्षित, पलटवाँ BBB व्यवधान और ट्यूमर पृथक के लिए ध्वनिक शक्ति कम microbubbles का उपयोग अधिक से अधिक शोध के हित को आकर्षित किया है (Hynynen, 2001 Sheikov 2004, McDannold 2006a, 2006b, 2005 Meairs). एट अल. McDannold (2006a) का प्रदर्शन है कि HIFU उपचार के समय में microbubbles के intravascular इंजेक्शन में एक 91% की कमी के परिणामस्वरूपसमय औसतन यांत्रिक नियंत्रण जो में कोई microbubbles उपस्थित थे, कम तापमान के ऊंचाई के साथ घावों को पैदा करने के लिए क्षमता दिखा तुलना क्षति के लिए ध्वनिक शक्ति दहलीज. बारी में घाव गठन के लिए थर्मल सीमा को कम करना बंद लक्ष्य ऊतक या हड्डी में गर्मी संचय की संभावना को कम करती है. इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि क्षणिक, स्थानीयकृत शक्तियों घाव गठन के लिए आवश्यक उन लोगों की तुलना में कम magnitudes के लगभग दो आदेश के साथ बीबीबी खोलने में अल्ट्रासाउंड उपचार परिणामों के समय में microbubbles की नसों में प्रशासन.

यह इस काम का लक्ष्य दोनों कम ध्वनिक transcranial HIFU द्वारा आवश्यक बिजली के अल्ट्रासाउंड microbubbles की तकनीक विकसित करने और microvascular permeabilization की डिग्री नियंत्रण है. मस्तिष्क में इस काम के दो विशिष्ट उपचारात्मक अनुप्रयोगों लक्षित दवा वितरण और गैर थर्मल पृथक हैं. वृद्धि की पारगम्यता और स्थायी पृथक के रिश्तेदार स्तर ध्वनिक शक्ति चाहे दवा वितरण में सुधार, स्थायी microvascular पृथक, या दवा वितरण का एक संयोजन और स्थायी microvascular पृथक पर जोर दिया है पर निर्भर करता है स्तर का समायोजन करके नियंत्रित किया जा सकता है. इस संभावित क्षमता को नियंत्रित करने के लिए कैसे microvessels जवाब एक विशिष्ट transcranial चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए हमारी रणनीति उपचार के अलग क्रमपरिवर्तन को विकसित करने का अवसर बनाता है. हम मानते हैं कि इस दृष्टिकोण के लिए काफी कैसे मस्तिष्क ट्यूमर का इलाज कर रहे हैं परिणत करने की क्षमता है.

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Disclosures: कंट्रास्ट अल्ट्रासाउंड औषधि असर nanoparticle वितरण और Microvascular एबलेशन के माध्यम से चूहे में Gliomas के उपचार लक्षित

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Acknowledgements: कंट्रास्ट अल्ट्रासाउंड औषधि असर nanoparticle वितरण और Microvascular एबलेशन के माध्यम से चूहे में Gliomas के उपचार लक्षित

एनआईएच HL74082 R01, Hartwell फाउंडेशन, और ध्यान केंद्रित अल्ट्रासाउंड सर्जरी फाउंडेशन द्वारा समर्थित है.

Materials: कंट्रास्ट अल्ट्रासाउंड औषधि असर nanoparticle वितरण और Microvascular एबलेशन के माध्यम से चूहे में Gliomas के उपचार लक्षित

Name Company Catalog Number Comments
ApoptTag kit Intergen Co. S7110
un-capped 85:15 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLAGA) Lakeshore Biomaterials Custom
Vivo Tag 680 VisEn Medical 10120 Used to Tag BSA
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich 363136
MicroTip Sonicator Misonix S-4000
Sequoia Simons Medical P.O.A Equipped with CPS
FreeZone 2.5 Labconco Corp. 7670020 Equipped with Nitrogen Trap
Methylene chloride (CH2Cl2) Fisher Scientific D37-500
FMT 250 VisEn Medical P.O.A
F-12K Nutrient Mixture GIBCO, by Life Technologies 21127-022
polyethyleneglycol-40 stearate Sigma-Aldrich 9004-99-3
distearoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipid, Inc 770365
Multisizer Coulter Counter Beckman Coulter Inc. P.O.A
Waveform Generator Tektronix, Inc. AFG-310
water-based ultrasound gel Parker Laboratories Inc. Aquasonic 100
Infusion pump Harvard Apparatus Harvard Apparatus PHD 2000
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) Pierce, Thermo Scientific 25952-53-8
N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) Pierce, Thermo Scientific 106627-54-7
Succinic anhydride Sigma-Aldrich 603902
Power Amplifier Electronic Navigation Industries ENI 3100LA
Needle Thermocouple Probe Omega Engineering, Inc. HYP1-30-1/2-T-G-60-SMPW-M
BioGel (P100, medium) Bio-Rad 150-4170
.75’’ diameter 1 MHz unfocused transducer Panametrics A314S

References: कंट्रास्ट अल्ट्रासाउंड औषधि असर nanoparticle वितरण और Microvascular एबलेशन के माध्यम से चूहे में Gliomas के उपचार लक्षित

  1. Chappell, J., Song, J., Burke, C., Klibanov, A. & Price, R. Targeted delivery of nanoparticles bearing fibroblast growth factor-2 by ultrasonic microbubble destruction for therapeutic arteriogenesis. Small, 10, 1769-1777 (2008).
  2. Chomas, J.E., Pollard, R., Wisner, E. & Ferrara, K. Subharmonic Phase-Inversion for Tumor Perfusion Estimation. IEEE, 2,1713-1716 (2001).
  3. Davda, J., Labhasetwar,V. Characterization of nanoparticle uptake by endothelial cells , Int J Pharm. 233, 51 (2002).
  4. Hynynen, K., & McDannolod, N. et al. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology, 220, 640 646 (2001).
  5. McDannold, N., Vykhodtseva, N. & Hynynen, K. Microbubble contrast agent with focused ultrasound to create brain lesions at low power levesl: MR imaging and histological study in rabbits. Radiology, 241, 95-106 (2006a).
  6. McDannold, N., Vykhodtseva, N. & Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: Association with cavitation activity. Phys Med Biol., 51, 793-807 (2006b).
  7. McDannold, N; Clement, G.T., Black, P., Jolesz, F., & Hynynen, K. Transcranial magnetic resonance imaging- guided focused ultrasound surgery of brain tumors: initial findings in 3 patients. Neurosurgery. 66, 323-332 (2009).
  8. Meairs, S. & Alonso, A. Ultrasound, microbubblesand the blood brain barrier. Progr Biophys Mol Biol., 93, 354-362. (2007).
  9. Optison . Food and Drug Administration. Optison, products insert. (2009).
  10. Sadlowskie, A., Chromas, J; Pollard, R., Bloch, S; Griffey, S., Wisner, W. & Ferrara, K. W. Mean Flow Rate and Intergrated Perfusion Estimates Obtained with Contrast-Assisted Ultrasound. IEEE Ultrasonics Symposium, 1977-1980 (2002).
  11. Song, J., Chappell, J. C., Qi, M., VanGieson, E. J., Kaul, S., & Price, R. J. Influence of injection site, microvascular pressure and ultrasound variables on microbubble-mediated delivery of microspheres to muscle. J Am Coll. Cardiol., 39, 726-731 (2002).
  12. Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. & Hynynen, K. Cellular mechanisms of blood-brain barrier opeing induced by ultrasound in the presences of microbubbles. Ultrasound Med. Biol., 30, 979-989 (2004).
  13. Tanter, J. & Fink, M. Focusing and steering through absorbing and aberrating layers: Application to ultrasonic propagation through the skull. J Acoust Soc Am., 103, 2403-2410 (1998).
  14. Yeh, C.K., Kruse, D.E., Lim, M.C., Redline, D.E. & Ferrara, K. W. A New High Frequency Destruction/Reperfusion System. IEEE, 1,433-436 (2003).

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