В естественных условиях Визуализация синаптических пузырьков В дрозофилы личинок Сегментные Аксоны

1. Подготовка реагентов

1. Подготовка подготовки рассечение буфер добавлением следующих соединений: 128 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 4 мМ MgCl _2, 2 мМ KCl, 5 мМ HEPES, и 36 мМ сахарозы в 1000 мл, рН до 7,2 и фильтр стерилизуют.

2. Подготовка к Dissection

1. Siligard куба: гель сократить примерно на один дюйм шириной, 1 дюйма в длину и около 1 см высокие. Гель куб помещают на предметное стекло во время вскрытия. Кубы может быть использована более одного раза.
2. Выводы: Выводы используются для вскрытия должны быть дополнительными короткими. Резкое часть нижней выводов minutien лучше всего работает в рассечение.
3. Нужна одна острыми ножницами весной микродиссекции.
4. Вам нужно два прекрасных наконечником щипцами.

3. Сборник Личинки

1. Блуждающие ^3-го возраста личинки, которые выражают GFP меткой пузырьков белка собираются на чашке Петри.
2. Личинки промывают в деионизованной воде, чтобы избавиться от всех пищи.

4. Живая вскрытии личинок

1. Личинка переходит к кубу рассечение гель на стекле. Личинка погружается в рассечение буфера.
2. Личинка тосковал на передней и задней с помощью двух тонких булавок с спинной стороной вверх.
3. Использование микродиссекции ножницы, небольшой надрез в средней линии у заднего конца. Из этого разреза надрез до передней. С помощью двух булавок, контактный вырезать кутикулу на боковых ребер.
4. Добавить каплю рассекает буфера. Осторожно выньте кишки, кишечника и жира тела щипцами. Большинство из этих тканей обычно ила во время спинной резки.
5. Замените буфер со свежими рассекает буфера. Личинка никогда не должны быть сухими и должны постоянно находиться в рассекает буфера.
6. Инкубацию использованием в естественных условиях MitoTracker маркеров или LysoTracker сделаны в это время, путем разведения в естественных условиях маркер рассечение буфера. После инкубации в маркер естественных мыться расчлененный личинка несколько раз (5 быстрой мойки) с использованием свежих рассекает буфера.
7. После замены последнего мыть толчок булавки в syligard и сразу же покровным. Личинки готов к наблюдению.

5. Живая съемка расчлененный личинки

1. Место покровное и геля на столик микроскопа и изображения с помощью инвертированного микроскопа.
2. Мы используем 100x линзы изображение меткой пузырьков внутри личиночной сегментарные нервы. GFP выражение в ячейке органов брюшной ганглий первую оценку до сегментарные нервы образ. Если надежные окрашивания GFP наблюдается в клеточных тел в брюшной ганглий, нервы то отображаемого и использоваться для оценки.
3. Использование двойной системы представления с фильтрами для CFP / YFP или RFP / YFP и программного обеспечения с разделением мы можем одновременно два изображения меткой белка в естественных условиях.

6. Представитель Результаты

Рисунок 1:. Представитель изображение, показывающее многих аксонального пузырьки на многих аксонального треков в личиночной сегментарный нервный Примечание капли GFP, представляющих аксонального накоплений.

Рисунок 2: представитель изображение, показывающее один аксонального трек со многими аксонального пузырьков внутри личиночной сегментарный нерв.

В естественных изображений синаптических пузырьков в транспорте дрозофилы личиночной сегментарные нервы является мощным инструментом для изучения механизмов в аксонального транспорта. Ранее мы уже использовали этот протокол для оценки транспортной динамики внутри личиночной нервы выражения расширена polyQ повторений, чтобы выяснить, как расширение повторяет повлиять на динамику пузырька транспорта ^3. Используя этот протокол скорость движения пузырьков может быть определена путем преобразования видеопотоков в кимографе. Использование генетики, GFP пузырьков транспорта могут быть визуализированы в пределах одного аксона или в течение нескольких аксонов с использованием специального GAL4 водителю ездить выражения GFP. Кроме того, динамика транспорта может также наблюдаться у личинок проведение мутаций конкретных генов. Далее две пузырьки с меткой различные варианты GFP (СФП или RFP) может быть одновременно визуализировать.