Generering av RNA / DNA-hybrider i Genomiskt DNA genom omvandling med hjälp av RNA-innehållande oligonukleotider

Shen, Y., Storici, F. Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (45), e2152, doi:10.3791/2152 (2010).

Syntetiska korta nukleinsyra polymerer, oligonukleotider (oligos), är de mest funktionella och omfattande verktyg för molekylärbiologi. Oligos kan produceras innehålla önskad DNA eller RNA-sekvens och kan vara beredd att ta ett brett utbud av bas och modifieringar socker. Dessutom kan oligos vara utformade för att efterlikna specifika nukleinsyra förändringar och därmed kan fungera som viktiga verktyg för att undersöka effekterna av DNA-skador och mekanismer för reparation. Vi fann att Thermo Scientific Dharmacon RNA-innehållande oligos med en längd mellan 50 och 80 nukleotider kan vara särskilt lämpade för att studera, in vivo, funktioner och konsekvenser av kromosomala RNA / hybrider DNA och ribonucleotides inbäddad i DNA. RNA / DNA hybrider kan lätt bildas under DNA-replikation, reparation och transkription, men mycket lite är känt om stabiliteten av RNA / DNA-hybrider i celler och i vilken utsträckning dessa hybrider kan påverka den genetiska integriteten i celler. RNA-innehållande oligos därför utgör en perfekt vektor att införa ribonucleotides i kromosomalt DNA och genererar RNA / DNA hybrider av utvalda längd och bas sammansättning. Här presenterar vi i protokollet om införlivande av ribonucleotides i genomet av eukaryota modellsystem jäst / Saccharomyces cerevisiae /. Ändå har vårt labb utnyttjas Thermo Scientific Dharmacon RNA-innehållande oligos att generera RNA / DNA-hybrider på kromosomnivå i olika cellsystem, från bakterier till mänskliga celler.

Logisk

Utnyttja användning av Thermo Scientific Dharmacon oligos, 50 till 80-Mers, här presenterar vi ett förfarande som grundas på en gen korrigering analys, genom vilka oligos kan överföra genetisk information för att arvsmassans DNA i jästceller, efter glödgning målet kromosomalt DNA. Framgångsrika inriktning på oligos görs av uppkomsten av jäst kolonier visa den förväntade fenotyp. Om den önskade genetiska modifieringen sker inom ett eller flera ribonucleotides ingår i oligo sekvens, flyter den genetiska informationen direkt från RNA-tarmkanalen till kromosomala mål-DNA, alltså en RNA / DNA blandformer på kromosom nivå under riktade processen. Den ribonukleotid / s av en Thermo Scientific Dharmacon RNA-innehållande oligo kan tjäna som mall för riktad genmodifiering via DNA-reparation syntes eller kan bäddas in i DNA och tjäna som mall under DNA-replikation. I dessa experiment använder vi den jäst / Saccharomyces cerevisiae / eukaryota modellsystem, men kan ett liknande tillvägagångssätt också tillämpas på andra organismer eller celltyper. I denna video använder vi en Thermo Scientific Dharmacon oligo utformad med homologi till ett mål jäst genomisk lokus och innehåller en ribonukleotid i mitten för att korrigera en mutation i målgenen. Efter omvandlingen med RNA-innehållande oligo, observerar vi en korrigering av de riktade webbplats vid en viss frekvens, vilket tyder på att RNA-tarmkanalen av oligo kunde införlivas i kromosomalt DNA och tjäna som mall för DNA-syntesen under DNA-replikation. Den genetiska informationen sker inom RNA-tarmkanalen är stabilt överförs till följande cellen generationer. Här beskriver vi de steg av jäst celltransformation från Thermo Scientific Dharmacon RNA-innehållande oligo och tillvägagångssätt för att upptäcka RNA informationen överförs i kromosomalt DNA.

A. Utformning av RNA-innehållande Oligo används i detta experiment

Vi har utformat en RNA-innehållande oligo att rätta till en genetisk defekt i jästen S. cerevisiae kromosomalt DNA på trp5 locus. Jästen stam som används i protokollet innehåller en muterad trp5 gen med en två-bas utplåning och en nonsensmutation (Figur 1A). Sådana jäst stammen är en tryptofan auxotrophic mutant och inte bilda kolonier på media utan tryptofan. Den DNA-sekvens av TRP5 genen finns på Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Thermo Scientific Dharmacon RNA-innehållande oligo används i detta protokoll är en 65-Mer med en 2-bas DNA-isättning, utformad för att korrigera deletionsmutation och en ribonukleotid utformade för att korrigera nonsensmutation av trp5 allelen (Figur 1A). Sekvensen av oligo är utformad enligt följande:
5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Detta oligo syntetiseras av Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) vid 200 nm skala, och är desalted, deprotected och användas utan SIDA rening.

B. Beredning av RNA-innehållande Oligo för jäst Transformation (modifierad från Storici et al. 2007 ¹⁾

1. Torka material som kommer att användas för försöket med oligo rör, pipetter, virvel, ställningar, försöksområdet och handskar bärs av prövaren med RNas sanering lösning för att avlägsna eventuella RNas föroreningar innan allt börjar. Använd RNas-fritt vatten, kemiska reagenser, rör och pipettspetsar i alla steg. Varje steg i detta experiment bör RNase-fri.
2. Resuspendera Thermo Scientific Dharmacon RNA-innehållande oligo erhållit från bolaget till 250 pmoles / l stamlösning med RNase-fria vatten och skaka kraftigt så att lös pelleten. Förvaras vid -80 ° C.
3. Omedelbart före övergången, tina RNA-innehållande oligo på is och späd till 50 pmoles / l med RNase-fria vattnet i RNase-fria rör. Varje förändring kräver en nmole av RNA-innehållande oligos.
4. Denaturera en utvald mängd RNA-innehållande oligos på 100 ° C värmeblock under 2 minuter för att eliminera sekundära strukturer oligos.
5. Omedelbart efter denaturering placera röret på is. Håll på is tills omvandling.
6. Som kontroll i experimentet en motsvarande DNA-Only är oligo används. Detta oligo är tinade från -20 ° C och förberett för omvandlingen som den RNA-innehållande oligo, som beskrivits ovan.

C. Omvandling av jästceller med hjälp av RNA-innehållande Oligo

1. Inokulera 5 ml rika YPD vätska med trp5 mutant jästceller och växa vid 30 ° C över natten (se material).
2. Överför 1,5 ml av natten kultur i 50 ml YPD vätska.
3. Inkubera cellerna i en 30 ° C shaker (225 rpm) i 4h.
4. Bered 1 och Lösning 2 immediately innan omvandling i RNase-fria rör (se material).
5. Överför cellodling till en 50 ml RNase-fria rör och centrifugera vid 3000 rpm, vilket motsvarar 1562 g, i 2 min. Pelleten av cellen nederbörden är ca. 0,3 cm ^3.
6. Avlägsna supernatanten och tvätta cellerna med 50 ml RNase-fritt vatten och snurra vid 3000 rpm i 2 min.
7. Upprepa steg 6 för 5 gånger för att bli av med odlingsmedium och RNaser som kan finnas i mediet så mycket som möjligt.
8. Avlägsna supernatanten och återsuspendera celler i 5 ml av lösning 1 och snurra vid 3000 rpm i 2 min.
9. Avlägsna supernatanten och återsuspendera celler i 250 l av lösning 1. Denna mängd celler är tillräckligt för 7-8 transformationer.
10. Alikvotera 50 l av cellsuspensionen i RNase-fria mikrocentrifugrör, tillsätt 20 ìl av RNA-innehållande oligo arbetslösning (1 nmole), eller 20 l DNA-only oligo arbetslösning (1 nmole), eller 20 l med sterilt vatten utan oligo för negativ kontroll. Tillsätt sedan 300 l av Lösning 2 för varje omvandling reaktion. Det finns ingen anledning att lägga till DNA lax spermier i processen för omvandling, som oligos fungera som bärare själva.
11. Vortex kraftfullt att blanda komponenter homogent.
12. Inkubera omvandling reaktioner vid 30 ° C i 30 min i en shaker.
13. Värme chock vid 42 ° C i 15 min.
14. Spinn ner celler vid 5000 rpm, vilket motsvarar 2236 g, för 4 min.
15. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 l med sterilt vatten.
16. Tag en alikvot av denna cellsuspension och späd den med sterilt vatten med 100.000 gånger och celler platta på en YPD tallrik med ca. 15 sterila glaspärlor och inkubera vid 30 ° C i 2 dagar.
17. Tavla alla återsuspenderade celler från varje omvandling reaktion på en petriskål av syntetiska komplett fast medium utan tryptofan (SC-TRP) med ca. 15 sterila glaspärlor och inkubera vid 30 ° C i 4-5 dagar (Figur 2).

D. Analys av Gene Korrigering av RNA-innehållande Oligo

1. Räkna antalet kolonier odlas på selektivt substrat (figur 2) samt på YPD medel för att beräkna frekvensen genen korrigering för RNA-innehållande oligo, DNA endast oligo och för no-oligo kontroll. Jämför det värde som erhålls. Spontan satsen i trp5 alleler med de två-bas strykningar och nonsensmutation är mindre än 10-9 i den använda jäst stam, så vi förväntar oss inga kolonier bildas på selektivt medium när inga oligos läggs till cellerna.
2. Streak ut flera slumpmässigt utvalda transformanten kolonier på YPD medel för att få enstaka koloni isolat. Vänta två dagar för koloni tillväxt, sedan ta flera (minst 5) enstaka kolonier och göra fläckar på YPD och på selektivt medium.
3. Design ett par primers att förstärka regionen (250-1,000 bp) är målet för den RNA-innehållande oligo av kolonin PCR (Figur 1B). Förfarandet för kolonin PCR är som följer (modifierad från Storici och Resnick, 2006 ^2).
   1. Resuspendera cellerna (ca 1 mm3) tas från enskilda korrigeringsfiler i 50 l vatten och tillsätt 1 enhet av lyticase. Inkubera vid rumstemperatur i 10 min, följt av inkubering i ett värmeblock vid 100 ° C i 5 minuter för att bryta celler och frigör genomisk DNA i lösning.
   2. PCR villkor: PCR-reaktion inkluderar 10 ìl av cellen resuspension lösning, 50 pmoles vardera framåt och bakåt grundfärger är 1 l 10 mm dNTPs, en enhet av Taq-polymeras, 5 ìl 10x buffert och justeras med sterilt vatten till en slutlig volym på 50 l. PCR-programmet är 3 min vid 95 ° C, 30 cykler av 30 s vid 95 ° C, 30 s vid 55 ° C och 1 minut vid 72 ° C, en slutlig förlängning tid 7 min vid 72 ° C, därefter prov förvaras vid 4 ° C. En förlängning på 1 min / kb antas för denna reaktion.
   3. Efter PCR prover körs på en 1% eller 2% (beroende på den förväntade storleken på PCR-produkten) agarosgel för observation av PCR-produkten (Figur 3).
4. Om den genetiska informationen överförs av RNA-innehållande oligo genererar en ny begränsning plats i jästen genomiska målregion (Figur 1B), är det möjligt att kontrollera korrekt överföring av information genom uppslutning av PCR-produkten med lämplig begränsning enzymet. Om ingen begränsning webbplats genereras av RNA-innehållande oligo, gå till steg 6. Digest PCR-produkter med en specifik begränsning enzym. Matsmältningen reaktion inkluderar 6 ìl av PCR-produkten, buffert, BSA (kanske inte behövs för vissa enzymer, se instruktion för det enzym som används), 0,5 l restriktionsenzym och sterilt vatten till 15 l. Prover inkuberas under 1 h vid den temperatur som är specifika för det använda enzymet.
5. Kör en osmält prov tillsammans med den smälta prover på samma rad på en 2% agarosgel att observera den genetiska modifieringen överfört By RNA-tarmkanalen av RNA-innehållande oligo (Figur 3).
6. Rena PCR-produkter med hjälp av en PCR-rening kit och förbereda dem för DNA-sekvensering. Skicka in prover för sekvensering med samma grundfärg som används för att förstärka produkten.
7. Analysera resultat av DNA-sekvensering med programvara som gör anpassningen av flera sekvenser med en vald referens sekvens (Figur 4).

E. alkali av RNA-innehållande oligo (Figur 5)

1. För varje reaktion, tillsätt 1 nmole (4 ìl 250 pmoles / l stamlösning) av RNA-innehållande oligo, eller DNA-oligo i ett 1,5 ml rör.
2. Tillsätt 4 l 1 M NaOH för hydrolys, alternativt lägga till 4 l H ₂ O som negativ kontroll, och inkubera vid 65 ° C i ett vattenbad i 1 h. Flytta sedan från vattenbadet till is.
3. Neutralisera med 2 ìl av 1,2 M HCl, 4 l 1 M Tris-HCl, och 4 l H ₂ O, alternativt 6 l H ₂ O och 4 l 1 M Tris-HCl för negativ kontroll. Håll på is tills omvandling.

Figur 1. Schematisk bild av den defekta trp5 genen och TRP5 allelen korrigeras av RNA-innehållande oligo. A) trp5 muterade genen innehåller en 2-bas radering (svarta trianglar) och 1-bas nonsensmutation (asterisk). Den enda tråd RNA-innehållande oligo med 2-bas isättning (blå slinga) och 1-RNA bas substitution (röd rektangel) genererar en Van91 Jag webbplats restriktionsenzymanalys (visas av konsolen) omvandlas till jästceller för att korrigera genetiska defekter av trp5 genen. B) Efter TRP5 genen är repareras av RNA-innehållande oligo (korrigerad baser anges som blå rektanglar), är Van91 jag platsen genereras i TRP5 genen. Ett 278 bp-fragment med endast en Van91 Jag begränsning plats i TRP5 gen PCR förstärks av ett par av primers (P1 och P2). Den 177 bp och 101 bp fragment genereras efter nedbrytning av P1 och P2 PCR-produkten av Van91 jag visas också.

Figur 2. Transformation resultat med RNA-innehållande oligo. A) Jästceller omvandlas utan oligo inte utgör någon koloni på SC-TRP medium, se tallrikar ab. B) plattor CG visa jäst kolonier växer på SC-TRP efter celler omvandlas med 1 nmole av RNA-innehållande oligo. C) plattor hl visa jäst kolonier växer på SC-TRP efter celler omvandlas med 1 nmole av motsvarande DNA-bara kontrollera oligo.

Figur 3. Upptäckt av genetisk information överföring från RNA-innehållande oligo att jästen kromosomala DNA genom begränsning nedbrytning av PCR-produkten förstärka de riktade genomiska regionen. 2% agarosgelelektrofores av PCR-prover förstärks av P1 och P2 och kokas med Van91 jag restriktionsenzym. Lanes 1, 8 och 15, DNA-stege med storlekar om 100, 200, 300, 400 och 500 bp visas till vänster, körfält 2, PCR-produkt på trp5 locus förstärks från arvsmassans DNA trp5 mutant stam, Lane 3, PCR produkten förstärks från genomiska DNA från en Trp + koloni målgruppen för DNA-only oligo, körfält 4-7, PCR-produkter förstärks från genomiska DNA från Trp + kolonier målgruppen för RNA-innehållande oligo, körfält 9 14 Van91 Jag begränsning matsmältning av PCR-produkter från körfält 2 till 7. Förekomst av oklippt PCR-produkten band i filer från 10 till 14 kan förklaras genom partiell matsmältningen genom Van91 jag på TRP5 lokus (CCACATTCTGG). Med tanke på att skära platsen för Van91 I (CCANNNN NTGG) kan ha flera sekvenser, kan webbplatsen genereras i TRP5 inte vara det mest optimala målet för enzymet. I själva verket, efter DNA-sekvensering av ovanstående PCR-produkter vi upptäcker några ytterligare förändringar utöver de som bärs av oligos (se Figur 4). Den 278 bp PCR-bandet förstärks av P1 och grundfärger P2 och matsmältningen banden produkten Van91 I 177 bp och 101 bp visas av pilarna till höger.

Figur 4. DNA-sekvensering Resultaten visar gen korrigering av RNA-innehållande oligo. A) DNA electropherogram av genomiska regionen målgruppen för RNA-innehållande oligo. G i DNA-sekvensen (blå box) härrör från RG på RNA-innehållande oligo. Även boxed är införandet av CG baser. Sekvensering resultat från alla andra PCR-produkter är också så tydliga som här, med fluorescerande signaler väl över bakgrunden. B) sekvenser av TRP5 region Trp + Transformants målgruppen för DNA-only oligo (T1) och RNA-innehållande oligo (T2-T5) match i samförstånd sekvens på toppen och jämförs med den i trp5 muterade celler innan inriktning av oligos (Genomiskt DNA, röd skuggade). Reparationen RNA-innehållande oligo på botten har två-base DNA insättning och en-base (G) RNA substitution markeras med rött. Regionerna förpackade i blått med gula nyansen visar att RNA innehåller oligo samt DNA-only oligo just rättade deletionsmutation och nonsensmutation i alla prover. De streckade linjerna markerar läget för RNA-innehållande oligo sekvens. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 4.

Figur 5. Alkali förhindrar gen korrigering av RNA-innehållande oligo. Omvandlingen frekvens av RNA-innehållande oligo (R) visas i den röda baren och att genom DNA-only oligo (D) visas i blå staplar. Felet stapel avser standardfel medelvärdet för 3 oberoende transformationer för varje oligo. De DNA-only oligo visar liknande omvandling frekvens utan och med NaOH behandling. Annorlunda, droppar omvandling frekvens av RNA-innehållande oligo till 0 efter behandling med NaOH. Därför är förberedelserna med RNA-innehållande oligo inte förorenats med DNA-only oligo, vilket är den observerade omvandling frekvens som är specifika för RNA-innehållande oligo.

Det faktum att RNA kan överföra genetisk information direkt till genomisk DNA i celler upptäcktes att utnyttja användningen av syntetiska RNA-innehållande oligos (Dharmacon syntetiseras oligos) ^1. Det var ett bevis på principen att celler kan använda RNA-innehållande molekyler eller RNA-endast sekvenser som mallar för DNA-syntesen. Användning av RNA-innehållande oligos inte bara lett till demonstrationen att genetisk information kan överföras direkt från RNA till genomiska DNA utan behov av en omvänd transkriberade DNA-kopior mellanliggande, utan även ett bevis på att RNA kan användas som homologa mall i reparation av en DNA-skador ^1,3. Den oligos kan göras av RNA-only eller innehåller bara en enda ribonukleotid inbäddad i en DNA-sekvens, som i exemplet vi presenterade här. RNA-innehållande oligo har en inbyggd ribonukleotid utformade för att korrigera nonsensmutation i genomiska defekta trp5 allel. Överföringen av genetisk information från ribonukleotid att arvsmassans DNA avslöjas av en förändring i fenotyp (cell växer på medellång saknar tryptofan) av målceller. Frekvensen av genen korrigering fås med RNA-innehållande oligo mäts och jämförs med hos en kontrollgrupp DNA-bara oligo. Genom att utföra denna analys gen korrigering i olika cell bakgrund, där vi mutera olika jäst gener, kan vi identifiera vilken faktor / er särskilt påverkar inriktning av RNA-innehållande oligos. Därmed kan vi avslöja mekanismer hur cellerna reglerar stabilitet av RNA / DNA-hybrider. Genom att helt enkelt utforma olika varianter av RNA-innehållande oligos vi kan bestämma sannolikheten för en viss RNA-tarmkanalen för att tjäna som mall i DNA-modifiering och vi kan bestämma stabiliteten i specifika RNA sekvenser inbäddad i DNA. Dessutom kan vi identifiera vad som är att föredra in vivo substrat för faktorer interagerar med RNA / hybrider DNA.

Medan flera in vitro studier, främst använder korta RNA-innehållande oligos, har utförts för att karakterisera den funktion av faktorer som kan känna igen RNA i en hybrid med DNA, såsom RNase H enzymer ^4, in vivo funktioner RNaser H samt som identitet av andra proteiner som kan påverka RNA / DNA-hybrid stabilitet fortfarande främst okänd. Möjligheten att utnyttja RNA-innehållande oligos av en betydande längd (50 till 80-Mers) och optimal kvalitet (såsom Thermo Scientific Dharmacon RNA-innehållande oligos) har öppna vägen för undersöka ett brett spektrum av molekylära processer direkt in vivo i celler av intresse. Som visas i denna video, omvandling med hjälp av RNA-innehållande oligos kräver i princip bara ytterligare några steg jämfört med omvandling med hjälp av DNA-molekyler, för att förhindra nedbrytning av RNaser. Således kan omvandling med hjälp av RNA-innehållande oligos inte är begränsat till jästen systemet, men tillämpas på en organism eller cell typ där omvandlingen av DNA oligos är duktig.

Sammanfattningsvis riktade celler genom RNA-innehållande oligos ger möjlighet att generera RNA / DNA-hybrider och ribonucleotides inbäddad i DNA in vivo i celler. Stabilitet, funktion och konsekvenser av dessa in vivo genererade RNA / DNA hybrider kan analyseras och karakteriseras, eventuellt avslöja okända mekanismer för DNA-reparation och avslöjar nya strategier för riktad genmodifiering.

Den videoproduktion för denna artikel var sponsrad av Thermo Fisher Scientific, som producerar reagenser och instrument som används i denna publikation.

Detta arbete stöddes av Georgien Cancer Coalition grant-R9028.

1. Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T.A., Gordenin, D.A. & Resnick, M.A. RNA-templated DNA repair. Nature 447, 338-41 (2007).
2. Storici, F., and Resnick, M. (2006) The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods Enzymol. 409, 329-345.
3. Storici, F. RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair. Curr Opin Mol Ther 10, 224-30 (2008).
4. Cerritelli, S.M. & Crouch, R.J. Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes. FEBS J 276, 1494-505 (2009).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.