En Ex-ovo Kyckling Embryo Culture lämpligt för bildbehandling och mikrokirurgi Applications

. 1 Ex-ovo Kultur protokollet:

1. Inkubera befruktade hönsägg
   1. Befruktade kyckling ägg kan förvaras vid 13 ° C upp till 5 dagar innan inkubering utan att initiera utveckling. En röd vinkyl kan behålla denna temperatur.
   2. Inkubera ägg trubbig uppåt i en 60% konstant luftfuktighet inkubator med kontinuerlig gungande vid 37,5 ° C i 72 timmar.
2. Förbered hängmattor (Figur 1a)
   1. Fyll ¾ av 9 oz plastmuggar med varmt sterilt vatten. En vanlig 9 oz Cup har en övre diameter på 8 cm. Vi fann att denna storlek var mest lämpade för länge kultur ansökan presenteras här.
   2. Skär ca 20 cm klänga wrap. Klistra fast runt om, på toppen av koppen genom att placera ett gummiband runt. Plast ska spridas ovanpå vattnet. Skär den överskjutande plasten runt bandet. Vi fann håller fast linda vara mest lämpliga för denna applikation eftersom den förhindrar vidhäftning äggulan, vilket resulterar i äggulan splitting under transporten.
   3. Torka av plasten med kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) fuktad med 70% etanol.
3. Ta bort ägg från inkubatorn efter 72 timmars inkubering.
4. Sterilisera äggen genom att torka ytan med 70% etanol fuktade kimwipes.
5. Lägg äggen horisontellt i 1-2 minuter för korrekt placering av embryot (Figur 1b). En äggkartong kan användas för att lägga ägg horisontellt. Embryon kommer att rotera till toppen efter 1-2 minuter.
6. Överför embryon till hängmattor aseptiskt i ett laminärt flöde huva.
   1. Med hjälp av en vass kant (som kanten på en plåthink eller en glasbägare) trycker ägget försiktigt tills det finns en liten buckla på undersidan av ägget (Figur 1c). Kom ihåg att embryot placeras på ovansidan.
   2. Sätt tummarna på motsatta sidor av buckla och dra skalen isär horisontellt (figur 1d).
   3. Placera äggulan med embryot samt albumin på hängmattan (Figur 1e). Albumin kommer att ge en dämpande miljö runt äggulan som absorberar stötar som orsakas av att flytta systemet och det ger näring till embryot länge kulturen praxis. Vatten under hängmattan kommer att se embryot kommer att stanna parallellt med marken under transport och fungera som en ledare av värme under avbildning om en vattencirkulation värmare används.
   4. Embryot bör redan vara placerad på toppen, om överföringen sker på rätt sätt. Om inte, använd en oskarp, steril objektet (dvs. trubbig spets av slutna böjd sax) och directionally smeka äggulan så att embryot roterar till toppen.
   5. Placera en 10 cm i diameter petriskål ovanpå koppen att försegla embryot.
7. Placera kopp kultur i inkubatorn inställd på 37,5 ° C. Om en UN-inkubator används, placera 1-2 september oz koppar fyllda med destillerat vatten håller luftfuktigheten på ~ 60% (Figur 1f).
8. Om odling embryon bortom embryonala Dag 7 ska krossade äggskal bitarna vara utspridda runt periferin av embryot som en kalcium källa för ben utveckling och mognad.

Tillbehör utrustning för utanför inkubatorn bildhantering / manipulation:

En cirkulerande vattenbad byggdes huset för att upprätthålla inkubation temperaturer medan bildbehandling eller manipulation (Figur 3). Ett vattenbad som kan passa koppen är ansluten via lämplig storlek slangen till en vattenreservoar. En värmare värmer upp vattnet i behållaren som regleras manuellt genom att följa vattentemperaturen. En vattenpump cirkulerar vattnet. Av bilder representation skildrar avbildning enkelt via ultrasongraphy / florescent mikroskopi (Figur 3).

Figur 1. Beredning av hängmatta och överföring av kyckling embryon till hängmattor.

Figur 2. Representativa resultat -. Annat skede kycklingembryon vuxit via ex ovo kultur tekniken Embryon från HH 17 och framåt kan odlas via denna teknik.

Figur 3. Schematisk och representativa bilder av vattencirkulationen system som används i samband med ex-ovo kultur system för att hålla embryon vid idealisk utveckling temperatur.

2. Utvalda applikationer:

I. mikroinjektion

Detta embryo kultur är lämplig för mikroinjektion applikationer där lösningar måste injiceras för att kärl för kontrast baserad avbildning (dvs. fluorescerande mikroskopi, mikro-beräknad topografi etc.) (Figur 4). Nedan visas mikroinjektion protokoll:

1. Förbered injektionen apparaTUS
   1. Mode drog 0,75 ID glas kapillärrör i avfasade spetsen mikronålar hjälp av en microforge. Storlek krävs spetsen beror på målet ven önskad diameter / flöde.
   2. Anslut sprutan till 0,03 tums ID silikonslang.
   3. Ladda slangen med den lösning som skall injiceras och anslut microneedle till slangen.
   4. Placera microneedle på mikromanipulator och spruta för att spruta innehavare eller sprutpump.
2. Tillsätt sterilt vatten i koppen därmed höja embryot. Vi upplevde att för riktig penetration av nålen i ett blodkärl (dvs. vitelline fartyg), är horisontell penetrationen nödvändig. Detta kräver embryot att vara på samma plan som kanterna på koppen.
   1. Ta ut gummibandet som håller plasten i embryot.
   2. Lyft ena sidan av plasten försiktigt och tillsätt lite sterilt vatten för att koppen.
   3. Fäst gummibandet på plasten igen.
3. Injicera lösningen på en embryonal fartyg. Enligt vår erfarenhet när det injiceras i en vitelline fartyg, mikronålar behövde storlek ca 1 / 10: ^e av fartyget diameter för att upprätthålla en effektiv genomblödning utan att orsaka blödning.
   1. Pump lösningen på microneedle garanterar inga luftbubblor bildas.
   2. Rikta spetsen på microneedle på det valda fartyget. För vitelline fartyg kommer att välja en gaffel område ge maximal område att tränga in i fartyget.
   3. Tryck nålen mot fartyget. Fartyget kommer först tillbaka. När nålen penetrerar, börja perfusion. Färgen på det strömmande blodet bör förändras med perfusion. Om färgförändring inte syns, kan nålen har trängt ut ur fartyget. I så fall långsamt dra tillbaka microneedle samtidigt pumplösning till färgförändring i fartyget sett. När perfusionen är klar, dra tillbaka microneedle ut ur fartyget.

Figur 4: mikroinjektion av en fluorescerande färg i kärlsystemet av en ex-ovo odlade kycklingembryo.

II. Mikrokirurgisk Förfarande - vänster förmak Ligation

Detta ex-ovo kultur inställning är idealisk för att utföra kirurgiska applikationer till kycklingembryon eftersom det ger full tillgänglighet till embryot. Nedan följer protokollet för ett exempel teknik, vänster förmak ligation (LAL) (Figur 5). Ingreppet görs cirka 24 timmar i kulturen perioden (HH24):

1. Förbered overhand knop ~ 0,5 mm diameter med 10-0 nylon kirurgiska sutur.
2. Med fin pincett, lokalt bort chorionic och allantois membran över embryot och lyft embryot från baksidan att rotera den vertikalt så att vänster sida av embryot är synlig.
3. Med fin pincett, ta bort hjärtsäcken över vänster förmak.
4. Rikta knuten över vänster förmak och dra åt. Knuten bör knytas så att förbjuda ~ 75% av den ursprungliga blodflödet till vänster. Skär kanterna av knut med microscissors och försiktigt ta bort och kasta överskott sutur.
5. Rotera embryot tillbaka till sin ursprungliga orientering (höger upptill).
6. Sham kontroller kommer att innebära att samma metod, men suturen kommer bara att passera genom och inte bundna. Effektiv LAL behandling (75% förträngning) kommer att bekräftas på 24 timmar efter operation, och diskvalificeras embryon kommer att uteslutas.

Figur 5:. En kontroll och en vänster förmak knyts ihop kycklingembryo Pilen visar den vänstra förmak, vilket är ca 75% mindre i knyts ihop embryot.

Optisk access och försöksverksamhet inom aviär embryon är utmanande på grund av begränsningar i äggskalet. Windowing begränsar betydligt det antal mikrokärl tillgänglig för injektion och mikrokirurgisk metoder ^8. Som ett resultat enbart tidiga embryon kan manipuleras och ständig kontroll är inte möjlig. Tidig ex-ovo kulturerna med Petriskålar var av begränsad användning på grund av otillräcklig kontroll av ytspänningen på embryot hindrat långsiktiga kulturen ^9. Vi förbättrade nyligen denna teknik med en sexkantig väger båt som håller acceptabel yta tenstion ^7, men dessa kulturer var svåra att transportera. Tekniken som presenteras här löser detta problem och väsentligt utökar den typ av experimentella metoder och tekniker avbildning som kan användas bland annat mikroinjektion och kirurgiska ingrepp. Som forskning fokuserar på att förstå senare morphogenic händelser kommer denna teknik att övervakning och anpassning av utvecklingen händelser som för närvarande omöjligt att experimentellt studera kontinuerligt.