Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

1. Hazırlık

1. Kapalı bir enstrüman Otoklav aşağıdaki öğeleri tepsi:
   1. Tırtıklı doku forseps - broşür doku taşıma için
   2. Doku makas (8 cm) - broşür doku ve yaprakçıkların kırpma
   3. Pamuk Swablar - broşür veya tüberkülü endotel tabakası izole için
2. Steril kollajenaz çözüm olun
   1. 4.0 gram toz DMEM 250 mL 18 M su ekleyin.
   2. 1.11 gram sodyum bikarbonat ekleyin.
   3. Kollajenaz, 180.000 adet (600 U / ml) ekleyin.
   4. % 1 (3ml) Penisilin / Streptomisin ekleyin.
   5. PH 7.2 'ye çözüm ayarlayın.
   6. 270 ml çözüm getirin.
   7. 0.2 mikron filtre geçerek çözüm sterilize edin.
   8. % 10 (30 ml) steril fetal sığır serumu ekleyin.
3. Steril endotel hücre orta olun
   1. 6.7 gram toz DMEM 400 mL 18 M su ekleyin.
   2. 1.85 gram sodyum bikarbonat ekleyin.
   3. (50 U / ml) 25.000 ünite heparin ekleyin.
   4. % 1 (5 mL) Penisilin / Streptomisin ekleyin.
   5. PH 7.2 'ye çözüm ayarlayın.
   6. 450 mL çözüm getirin.
   7. 0.2 mikron filtre geçerek çözüm sterilize edin.
   8. % 10 (50 ml) steril fetal sığır serumu ekleyin.
4. Steril interstisyel hücre orta olun
   1. 13.37 gram toz DMEM 800 mL 18 M su ekleyin.
   2. 3.7 gram sodyum bikarbonat ekleyin.
   3. % 1 (10 ml) Penisilin / Streptomisin ekleyin.
   4. PH 7.2 'ye çözüm ayarlayın.
   5. 900 mL çözüm getirin.
   6. 0.2 mikron filtre geçerek çözüm sterilize edin.
   7. % 10 (100 ml) steril sığır serumu ekleyin.

2. Kalp Vana Broşürler izolasyonu

1. Aort kökü kurban sonra kalp ve hemen aseptik Vergi.
2. Kan aort kökü soğuk steril DPBS ile iyice durulayın. VEC ölüm ve bakteriyel kontaminasyon sınırlamak için tüm kan bileşenleri en kısa sürede kaldırmak için zorunludur. Antibiyotikler ve antimikotikleri VEC potansiyel zararlı olduğundan bu aşamada önerilmemektedir.
3. Doğrudan, 12 mL soğuk DPBS dolu steril 15 ml konik tüp kök ve yerden kapakçıkların (3 valf başına) yalıtın. Taze DPBS enkaz ve dolum kaldırmak için birkaç kez çalkalayınız.
4. Buz üzerinde laboratuar geri taşınması.
5. Laboratuarda varışta, steril kaputun altındaki doku ile kap yerleştirin.

3. Endotel Katman İzolasyonu

1. Valf başına soğuk kollajenaz çözüm (3 broşürler) 3ml steril bir 35mm çanak doldurun.
2. Kollajenaz çözümü ile dolu çanak içine 15 ml tüp üç broşürler yerleştirin.
3. 37 5-10 dakika doku inkübe ° C
4. Endotel tabakası broşürün yüzeyine kuru steril bir çubukla çevirerek yavaşça çıkarın. Kayma uygulanan dönme yönü ve miktarı numune saflık için kritik öneme sahiptir. Çubukla dönme elinizi doğrusal hareket kontrollü bir kesme oluşturmak için bir ters yönde olmalıdır. Bu kayma, doku endotel hücreleri ne asansörleri. Kuvvet uygulanan miktar doku direnci hissediyorum ama, bazal membran nüfuz için yeterli olmalıdır.
5. Bazen, dab kollajenaz çözüm içindeki çubukla ucu lifleri hücreleri çıkarmak için. Sürüntü tamamlandıktan sonra, endotel tabakasının doku öncesine göre biraz daha yumuşak hissediyorum gerekir.
6. Hücre süspansiyonu / kollajenaz toplayın ve yeni bir 15 mL steril tüp transferi.
7. Pelet için 5 dakika herhangi bir izole hücreler için tüpleri 1000 rpm'de santrifüj ve süpernatant aspirat. Iyi interstisyel hücreler izole Eğer bu hücreler santrifüj edilirken, bu protokol yapmak.
8. 3 ml, 15 ml tüpler endotel porcine orta, ikinci kez santrifüj ve aspirat medya. Bu ikinci santrifüj ucu lifleri gibi bazı istenmeyen malzeme filtre yardımcı olur.
9. Santrifüje endotel hücreleri, kolajen ile bir ön kaplı T-25 balonuna (kullanım santrifüj tüp başına 1 balon) 5 ml endotel porcine orta ve plaka hücrelerin yeniden askıya.
10. Hücrelerin endotel orta değiştirmeden önce en az 2-3 gün büyümesine izin. Bu hücrelerin kurtarmak ve izolasyon işlemi oldukça sert ve hücre verimi düşük olabilir bu yana bölmek yardımcı olur. Temas inhibisyonu hücre dönüşümün yol açabileceği için izdiham yakın geçiş hücreleri için çok önemlidir.

4. Side Özel İzolasyon 60 mm Kültür Bulaşık hazırlanması

1. Alüminyum folyo ile (Line 60 mm cam petri kaplarına leafle başına 2 cam yemeklerit). Alüminyum folyo, cam petri diğer izolasyonların yeniden böylece, parafin giderilmesine yardımcı olur.
2. Yaklaşık yarısı dolu, bulaşıkları içinde parafin boncuklar yerleştirin ve otoklav için kapak.
3. Otoklav tamamlandı ve parafin eritilmiş sonra, serin bir düz yüzeye çanak topluluk taşıyın. Parafin soğudukça, sertleşecek ve iğne destek olacak bir katman oluşturun.
4. 30 dakika sonra, sterilize çanak broşür doku hareketsiz için bir izolasyon odası olarak kullanılan olabilir.

5. Side Özel Endotel Layer izolasyonu

1. Broşürler tarafında belirli bir izolasyonu için hazırlanan 60mm kültür kaplarına 15 mL tüpler ve yerden çıkarın.
2. Broşürün ventricularis yan fibrosa yan maruz bırakarak parafin yüzey üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde işleyebilirsiniz. Endotel tabakasının açığa çıkarmak için broşürün kenarlarına iğne.
3. 37 her biri için (yukarı doğru bakan) endotel yüzeyinde bir kaç damla soğuk kollajenaz koyun ve 5-10 dakika doku inkübe ° C
4. Daha önce olduğu gibi, endotel tabakası broşürün yüzeyine kuru steril bir çubukla çevirerek yavaşça çıkarın. Kayma uygulanan dönme yönü ve miktarı numune saflık için kritik öneme sahiptir. Çubukla dönme elinizi doğrusal hareket kontrollü bir kesme oluşturmak için bir ters yönde olmalıdır. Bu kayma, doku ve başka bir şey endotel hücreleri kaldırır ne olduğunu. Kuvvet uygulanan miktar doku direnci hissediyorum, fakat doku içinde nüfuz etmez yeterli olacaktır.
5. Bazen, dab kollajenaz çözüm içindeki çubukla ucu lifleri hücreleri çıkarmak için. Sürüntü tamamlandıktan sonra, endotel tabakasının doku öncesine göre biraz daha yumuşak hissediyorum gerekir.
6. Hücre süspansiyonu / kollajenaz toplayın ve yeni bir 15 mL steril tüp transferi. Etiket üzerinde yan özgüllük (aynı valf broşürler bir araya toplanmış olabilir) belirtiniz.
7. Ventricularis yan adımları tekrarlayın (5,3-5,6) maruz kalan ve böylece yeni bir kültür çanak broşürler aktarın.
8. Tüm hücre süspansiyonu / kollajenaz toplandıktan sonra, pelet herhangi bir izole hücreler 5minutes için tüpleri 1000 rpm'de santrifüj ve süpernatant aspirat. Iyi interstisyel hücreler izole Eğer bu hücreler santrifüj edilirken, bu protokol yapmak.
9. 3 ml tüpler endotel porcine orta, ikinci kez santrifüj ve medya aspirat. Bu ikinci santrifüj ucu lifleri gibi bazı istenmeyen malzeme filtre yardımcı olur.
10. Santrifüje endotel hücreleri, kolaj (santrifüj tüpüne başına 1 balon) ile bir ön kaplı T-25 balon endotel porcine orta ve plaka hücrelerin 5 ml yeniden askıya.
11. Hücrelerin endotel orta değiştirmeden önce en az 2-3 gün büyümesine izin. Bu hücreleri kurtarmak ve izolasyon işlemi oldukça sert olduğundan bölmek yardımcı olur. Verim çok düşük olduğunu fark ederseniz, daha küçük bir balon veya iyi plaka hareket, hücre-hücre adezyon, hücre büyümesini teşvik düşünün. Temas inhibisyonu hücre dönüşümün yol açabileceği için izdiham yakın geçiş unutmayın.

6. İnterstisyel Hücreleri İzolasyon

1. Valf başına kollajenaz çözüm (3 broşürler) 10 ml ile 15 ml steril bir santrifüj tüpüne doldurun.
2. Endotel hücreleri broşürler sürüntü sonra hemen kollajenaz çözümü ile ilgili 15 mL tüp koyun.
3. Yaklaşık 12 ila 18 saat boyunca inkübe edin (hafifçe ajitasyon istenirse).
4. Serolojik bir pipet yardımıyla hücre süspansiyonu / kollajenaz homojenize olana kadar bozulmuş doku hafifçe karıştırın. Bu homojenizasyon doku break up ve interstisyel hücreleri serbest yardımcı olur.
5. 1000 rpm'de 5 dakika sindirilir doku Santrifüj ve süpernatant aspire.
6. 15 mL tüplere 5 ml interstisyel porcine orta, ikinci kez santrifüj ve supernate aspire.
7. Santrifüj 5 ml interstisyel porcine orta ve plaka hücrelerin endotel hücreleri yeniden askıya T-75 balonuna (santrifüj tüp başına 1 şişesi kullanın).
8. Interstisyel hücre orta değiştirmeden önce en az 1-2 gün hücrelerin büyümesini sağlar. Beklenen endotel hücreleri, fakat çok daha fazla doku enkaz olacak. Hücreler de hücre verim ve doğaları nedeniyle endotel hücreleri daha hızlı izdiham büyümek gerekir.

7. Temsilci Görüntüler

Şekil 1: 2-3 gün yazılan izolasyon izole hücrelerinin morfolojisi. (A) VEC tipik bir endotel morfolojisi ve form büyümeyi teşvik etmek için kümeler sergilerler. (B) VIC morfolojisi, genellikle iğsi ve şişeyi boyunca yayılır miyofibroblastlar benzer.

Kapak biyoloji bir anlayış izole teknik zorluklar ve kapak endotelyal hücrelerin kültür saf popülasyonları tarafından bozulmuş oldu. Tipik izolasyon teknikleri, altta yatan bazal matris veya endotel yapışkan ^bağları 2,3 kimyasal disosiasyon enzimatik sindirim içerir . Ön izolasyon deneyleri niteliksel disosiasyon ajanlar ve farklı inkübasyon süreleri değerlendirildi. Bu deneylerin sonuçları, 60 dakika kadar EDTA (veya tripsin-EDTA) kuluçka yerinden oynatmamaya hücreleri başarısız olduğunu gösterdi. Ancak, 5-10 dakika collagense sindirim saf kapak endotel hücreleri (Tablo 1) kullanılabilen bir numara almak için etkili oldu. Dispase, özellikle temel ^matris 4 ana bileşenleri olan kollajen tip IV ve fibronektin hedef yetenekli bir metalloproteaz ile ilave gibi diğer enzim çözümleri öne sürülmüştür . Kurtarılmış hücrelerinin klonal genişleme veya manyetik seçim yöntemlerini ⁵ gibi ek işlemler ile arındırılmalıdır.

Son kanıtlar, aort kapak hücre fenotipleri değerlendirirken zorluklara yol açabilir hücre tipleri çok heterojen bir dağılım içerdiğini öne sürmüştü. Vasküler endotel aksine, VEC da sıvı akış ⁶ yönüne dik hizada olmalıdır. VEC transkripsiyonel profilleri yan özgüllük ve mekanik çevreye bağlıdır. Aort karşı ventrikül yan endotel farklı endotel fenotipleri in vivo olarak tespit edildi. Gen ekspresyon profilleri, aort yan kapak endotel kireçlenme tarafına eğilimli ancak antioksidan ^{mekanizmaları} 7 tarafından inflamatuar başlatılması karşı korumalıdır öneririz . Kayma akması varlığı, endotel hücreleri aşağı latent fenotip korumak için, BMP-4 ve POSTN kalsifik genler düzenlenir. Kesme akışı ventriküler endotel koruması ⁸ olası bir açıklama kondro / osteojenik farklılaşma, endotel hücre tipleri için koruyucu bir tedbir olarak hareket gibi görünüyor.

Insan akciğer aort kapakları Klon izolasyonların bir spektrum var farklı miktarda α-SMA, CD144 ve CD31 ifade endotel atalarıdır ileri sürmüşlerdir. Bazıları, özellikle değişen ^derecelerde 9 TGFB2 yanıt, mezenkimal fenotip geçiş EMT için analog gösterildi . Klon izolasyon hücre popülasyonlarının arındırıcı etkili bir şekilde kanıtlamak, ancak genellenebileceğine fenotipik benzersizliği olabilir belirli alt popülasyonlar için seçer. Bu, diğer birçok hücre tiplerindeki sıfırdan farklı miktarlarda mevcutsa, yüzey endotel için çok önemlidir. Bunlar, bütün bunlar, bir ya da daha fazla endotel ^{gibi özellikleri 10,} 11 ifade edebilir dolaşan endotel hücreleri, kemik iliği kökenli hücreler, monositler, içerir. Buna ek olarak, klonal izolatlar noktası olmayan birçok progenitör fenotipleri senesced veya dediferansiye hangi deneyler için uygun hücre sayıları ulaşmak için birçok hücre bölünmeleri uğrarlar. Bu nedenle, burada açıklandığı gibi primer hücre izolasyonu, yerli vana endotel nüfusun en iyi şekilde temsil verir. Zorluk ortaya çıkan alt-fenotipleri içsel ya da dışsal uyaranlara diferansiyel yanıtlardan ortaya olmadığını tespit etmek olacaktır. Bu yaklaşımla, bir belirli tedavilere yanıt olarak her biri ve bunların sonuçları göreli yaygınlığını belirlemek için gerekir.

Manyetik sıralama yöntemleri de hücre popülasyonlarının arındırıcı bir yolu ancak, antikor etiketleme koşulları ve türetilmiş hücre popülasyonu üzerinde son derece bağımlıdır. Giderek artan bir anlayış valf hücre popülasyonlarının, CD31 gibi endotel belirteçleri, CD144, ve α-SMA negatif saf bir kapak nüfus için sıralamak için yeterli olmayabilir. Klon izolasyonların endotel hücreleri, sıralama ile mümkün yanlışlıklar önde gelen marker ifade çok geniş bir yelpaze içerdiğini kanıtlamıştır. Sıralaması endotel hücreleri CD31 sıralaması edildiğinde, örnek saflık, neredeyse% 96 arttı. Ancak, interstisyel hücreler, bir gün sonrası ^izdiham 4 yetiştirilen kültürler yeniden başladı . Manyetik sıralama bir seçenek olmasına rağmen, bir CAD-11 için pozitif ve periostin ⁶ negatif gibi ek göstergeler ve ifade düzeyleri için sıralama göz önünde bulundurmalısınız.

Yalıtma ve kalp kapakçığı endotel hücreleri (VEC) saf kültür popülasyonları için bir yöntem sağlar. Bu yöntemi kullanarak, klonal izolasyon ve manyetik seçim yöntemleri gibi ek işlemler bir temsili nüfus tarafında özel endotel hücreleri elde etmek için ortadan kaldırılabilir. Hücre morfolojisi, işlevsel özellikleri, birden fazla belirteçler ve ekspresyon düzeyleri nüfus değerlendirirken bütün olarak düşünülmelidir.